利拉魯肽聯(lián)合生長分化因子-11重組蛋白對db/db糖尿病小鼠的心肌保護作用及對TGF-β1、PPARγ和Caspase-3的影響

羅小莉 羅文杰 李敏 楊金蓉

(1雅安職業(yè)技術(shù)學院，四川 雅安 625000；2雅安市人民醫(yī)院；3四川省成都中醫(yī)藥大學)

糖尿病心肌病是2型糖尿病(T2DM)的主要并發(fā)癥之一〔1〕。利拉魯肽(Li)是一種新型的治療T2DM的藥物，對糖尿病引起的腎臟炎癥具有較好的治療效果〔2〕。生長分化因子(GDF)-11是胚胎發(fā)育過程中的重要因子，并且在多種細胞的形成和分化中起著重要作用，有保護胰島β細胞的作用，但是關于GDF-11對糖尿病心肌病的研究較少〔3〕。轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1可通過調(diào)節(jié)胞外基質(zhì)促進器官纖維化，也是引起心肌病的重要因素〔4〕。過氧化物酶體增殖劑激活受體(PPAR)γ具有調(diào)節(jié)代謝、抑制炎癥反應的作用〔5〕。Caspase-3是細胞凋亡的主要執(zhí)行蛋白，參與糖尿病心肌細胞凋亡的發(fā)生〔6〕。本文主要分析Li聯(lián)合GDF-11對db/db糖尿病小鼠的心肌保護作用，并通過分析其對TGF-β1、PPARγ和Caspase-3的影響分析其可能的機制。

1 材料與方法

1.1動物與試劑 SPF級T2DM模型db/db小鼠(BKS.Cg-Dock7m+/+Leprdb/JNju)及db/m小鼠購于南京大學模型動物研究所(SCXK(蘇)2015-0001)。利拉魯肽(諾和諾德，丹麥)。人重組GDF-11蛋白(Pepro Tech，美國)。蘇木素-伊紅(HE)染色和Masson染色試劑盒購及酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(武漢華美，中國)。TGF-β1一抗，PPARγ一抗，Caspase-3一抗及相應二抗購買于Abcam公司(美國)。聚偏氟乙烯(PVDF)膜購于Bio-Rad(美國)。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，SYBR Prellix Ex TaqTM實時PCR試劑盒購自TaKaRa(日本)。PCR引物由Genewiz(蘇州，中國)設計并合成。

1.2分組和處理方法 db/db小鼠48只隨機分為模型組、Li組、GDF-11組及Li+ GDF-11組，每組12只；db/m小鼠12只為對照組。適應性喂養(yǎng)1 w后進行藥物干預。Li組腹腔注射Li 1 mg/(kg·d)，1次/d；GDF-11組腹腔注射GDF-11 0.3 mg/(kg·d)，1次/d；Li+ GDF-11組同時注射Li和 GDF-11(劑量、用法同以上兩組)。用藥均8 w。

1.3觀察指標

1.3.1小鼠活動狀態(tài)及空腹血糖(FBG) 觀察并記錄干預后各組小鼠的活動狀態(tài)，分別在干預前和干預后檢測每只小鼠的FBG。

1.3.2HE染色 干預后將小鼠處死，取左心室組織，立即在甲醛中室溫下固定24 h。酒精脫水，石蠟包埋。將樣品切成4 μm厚的均勻薄片并置于APES涂覆的載玻片上。使用二甲苯將切片脫石蠟，水化，HE染色。采用蘇木精在室溫下溫育5 min。洗滌后，用曙紅在室溫下溫育1～3 min。梯度乙醇洗滌后，使用中性凝膠進行密封，顯微鏡下觀察。

1.3.3Masson 染色 取心臟組織切片，使用Masson試劑染色，按照試劑盒說明書步驟操作，觀察心肌組織纖維化情況，計算纖維化染色面積。

1.3.4ELISA檢測心肌酶指標 小鼠眼眶取血，ELISA法檢測血清中乳酸脫氫酶(LDH)和肌酸激酶同工酶(CK-MB)水平，根據(jù)試劑盒說明書加入工作液，計算濃度。

1.3.5Western印跡檢測TGF-β1、PPARγ和Caspase-3蛋白水平 細胞裂解后收集總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，通過PVDF膜進行轉(zhuǎn)膜，分別加入TGF-β1、PPARγ和Caspase-3一抗，室溫震蕩2 h，4℃孵育過夜，加入二抗，GAPDH作為內(nèi)參。

1.3.6qPCR檢測TGF-β1、PPARγ和Caspase-3的mRNA水平 細胞裂解后收集總mRNA，95℃激活DNA聚合酶5 min后進行PCR，采用40個循環(huán)的兩步PCR(95℃10 s和60℃30 s)，最終75℃延伸10 min，4℃保持，GAPDH作為內(nèi)參，使用2-ΔΔCT法分析mRNA水平。

1.4統(tǒng)計學處理 采用Prism Graphpad6.0軟件，在Turkey多重比較之后，使用單因素方差分析(ANOVA)。

2 結(jié) 果

2.1各組小鼠活動狀態(tài)、血糖比較 對照組在實驗全程毛色光亮，尿量正常，活動正常；模型組在實驗全程出現(xiàn)脫毛并且毛發(fā)無光澤，明顯消瘦，活動減少；Li組和GDF-11組狀況有所緩解，Li+ GDF-11組狀態(tài)和活動情況較Li組和GDF-11組好。對照組PBG〔(6.32±0.95)mmol/L〕明顯低于其余各組(P<0.05)；藥物干預后Li組、GDF-11組FBG〔(14.75±2.56)mmol/L，(18.56±3.06)mmol/L〕顯著低于模型組〔(24.32±3.57)mmol/L〕，并且Li+ GDF-11組FBG〔(10.54±2.13)mmol/L〕顯著低于Li組和GDF-11組(P<0.05)。

2.2HE染色結(jié)果比較 對照組心肌細胞形態(tài)正常，結(jié)構(gòu)完成，排列整齊，染色均勻；模型組心肌細胞肥大，結(jié)構(gòu)模糊、排列紊亂，細胞核固縮；Li組和GDF-11組細胞損傷程度較模型組降低；Li+ GDF-11組的心肌細胞結(jié)構(gòu)接近正常，結(jié)構(gòu)趨緊整齊，細胞肥大顯著緩解，見圖1。

圖1 各組心肌細胞HE染色結(jié)果(×400)

2.3Masson染色結(jié)果比較 Masson中紫色或深紫色為心肌細胞，藍綠色為膠原纖維。結(jié)果顯示對照組細胞核明顯，細胞排列整齊，纖維化程度低，膠原纖維陽性染色面積為(3.47±0.35)%，明顯低于其余各組(P<0.05)；模型組出現(xiàn)細胞腫脹及結(jié)構(gòu)變化，并且出現(xiàn)大量的纖維，膠原纖維陽性染色面積為(36.76±2.45)%；Li組和GDF-11組纖維化程度顯著低于模型組，膠原纖維陽性染色面積分別為(21.42±1.98)%，(20.53±2.25)%；明顯低于模型組(P<0.05)；Li+ GDF-11組纖維化程度顯著低于Li組和GDF-11組，膠原纖維陽性染色面積為(9.64±1.06)%，明顯低于Li組和GDF-11組(P<0.05)，見圖2。

圖2 各組心肌細胞Masson染色(×400)

2.4各組LDH和CK-MB水平比較 模型組血清LDH和CK-MB顯著升高(P<0.05)，Li組和GDF-11組LDH和CK-MB水平顯著低于模型組(P<0.05)，而Li+ GDF-11組的LDH和CK-MB水平顯著低于Li組和GDF-11組(P<0.05)，見表1。

2.5各組TGF-β1、PPARγ、Caspase-3蛋白和mRNA水平比較 模型組的TGF-β1、Caspase-3表達水平顯著升高而PPARγ顯著降低(P<0.05)，Li組和GDF-11組TGF-β1和Caspase-3顯著低于模型組而PPARγ顯著高于模型組(P<0.05)，Li+ GDF-11組TGF-β1和Caspase-3顯著低于Li組和GDF-11組而PPARγ顯著高于Li組和GDF-11組(P<0.05)，見表2。

表1 各組LDH和CK-MB水平比較

與對照組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05；與Li組比較：3)P<0.05；與GDF-11組比較：4)P<0.05；下表同

表2 各組TGF-β1、PPARγ、Caspase-3蛋白和mRNA水平比較

3 討 論

糖尿病已成為威脅中國人口健康最常見的疾病之一，其中主要為T2DM，占總發(fā)病人群的90%以上〔7〕。糖尿病作為一種全身性疾病，會引發(fā)多種器官損傷，包括腎損傷、視網(wǎng)膜損傷、心肌損傷等，高糖環(huán)境會引起廣泛的血管病變，誘發(fā)心肌細胞壞死或纖維化導致心肌病，嚴重者出現(xiàn)心力衰竭甚至死亡，但目前尚無用于治療糖尿病心肌病的特效藥物〔8〕。

有效控制血糖是治療糖尿病心肌病的基礎，Li是一種胰高血糖素樣肽(GLP)-1類似物，可以升高葡萄糖依賴性促胰島素釋放多肽(GIP)水平，從而促進胰島素釋放、降低血糖〔9〕。GDF-11具有多種生物學功能，包括調(diào)節(jié)脂代謝、保護心肌細胞等〔10〕。本研究結(jié)果顯示，Li和GDF-11可顯著減少心肌損傷，保護心肌功能并抑制心肌細胞纖維化，Li和GDF-11聯(lián)合應用可更顯著減少心肌細胞損傷和纖維化，改善心肌酶譜指標。GDF-11可能通過調(diào)節(jié)脂代謝改善血糖水平，而血糖水平減低也會改善心肌細胞的高糖微環(huán)境及氧化應激微環(huán)境，從而保護細胞。此外，GDF-11本身也具有一定的器官保護作用。Zhang等〔11〕研究顯示GDF-11可改善急性腎臟損傷，也有研究認為GDF-11可改善心肌細胞缺血/再灌注損傷〔12〕。這提示在有Li的條件下，GDF-11可能通過改善血糖水平保護心肌細胞，也可能直接發(fā)揮保護心肌細胞的作用。

心肌細胞纖維化是心肌損傷的重要原因之一，TGF-β1被認為是引起器官纖維化的主要影響因素，TGF-β1會上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑(TIMPs)的分泌、抑制其降解，從而引起纖維化〔13〕。高糖環(huán)境引起的心肌細胞凋亡增加也是糖尿病心肌病的發(fā)病機制之一，Caspase-3是細胞凋亡的主要執(zhí)行因子〔14〕。PPARγ在糖尿病及相關并發(fā)癥的發(fā)生中均發(fā)揮重要作用，PPARγ參與葡萄糖代謝，并參與炎癥反應，糖尿病心肌損傷中PPARγ水平顯著降低〔15〕。過往研究顯示GDF-11可通過改善胰島β細胞的功能調(diào)節(jié)血糖〔16〕，這提示GDF-11可能與Li協(xié)同作用，進一步降低血糖水平。張昊駒等〔17〕研究認為GDF-11可通過調(diào)節(jié)TGF-β通路保護神經(jīng)細胞損傷有保護作用。最新的國內(nèi)研究顯示GDF-11可抑制T2DM心肌細胞凋亡〔18〕。李歡等〔19〕研究認為GDF-11對高糖環(huán)境下心肌細胞損傷。最新研究顯示PPARγ可抑制T2DM小鼠心肌細胞纖維化〔20〕；和彩玲等〔21〕研究也顯示，促進PPARγ相關通路可改善db/db小鼠心肌損傷。這提示，在Li條件下聯(lián)合GDF-11，可通過上調(diào)PPARγ進一步調(diào)節(jié)血糖，并通過抑制心肌細胞纖維化，同時抑制TGF-β1而保護心肌細胞，抑制心肌細胞凋亡，保護心功能。

綜上所述，Li與GDF-11聯(lián)合使用可進一步控制血糖，通過促進PPARγ和TGF-β1表達調(diào)節(jié)代謝，抑制心肌細胞纖維化和凋亡，緩解糖尿病心肌細胞損傷，但是關于Li與GDF-11聯(lián)合使用的效果和安全性還需要進一步研究。