溫肺降濁方對血管性癡呆大鼠海馬CA1區神經元凋亡及Bcl-2、Bax蛋白表達的影響

吳林 唐農 麻小梅 陳煒 鄭福奎 趙海濤 白碩宇 曾冬娟 楊惠丹 鄧燕

(1廣西中醫藥大學，廣西 南寧 530001；2廣西中醫藥大學附屬國際壯醫醫院；3廣西中醫藥大學第一附屬醫院)

在導致癡呆的眾多病因中，血管性癡呆(VD)是僅次于阿爾茨海默病(AD)的第二大病因，為老年人的多發病，VD給社會和家庭帶來沉重的經濟負擔，已引起國內外的極大關注，至今仍沒有確實有效的藥物治療VD，因此，積極探尋防治VD的有效途徑，具有重要的社會價值和現實意義。研究已表明VD的學習記憶功能障礙與海馬CA1區神經元的凋亡有關，Bcl-2、Bax等凋亡相關蛋白的改變最終可導致海馬區神經元凋亡〔1〕。本實驗通過制作VD模型大鼠，對VD大鼠海馬CA1區神經元凋亡及Bcl-2、Bax蛋白表達的影響進行研究，探討溫肺降濁方改善VD的可能機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 3月齡健康雄性SPF級SD大鼠120只，體重(200±50)g，由廣西醫科大學動物實驗中心提供(許可證號：SCXK桂2009-0002)。

1.2主要設備及試劑 日本奧林巴斯公司生產的CX-31型電子顯微鏡，由成都泰盟科技有限公司生產的WMT-100型Morris水迷宮設備全套，美國Media Cybernetics公司生產的多功能圖像分析管理系統，德國萊卡生產的RM2015型全自動石蠟切片機，美國Thermo公司生產的CA91786型 UVP凝膠成像系統，DAB(北京中杉金橋公司生產，批號：ZLI-9032)，胃蛋白酶 Pepsin(美國Sigma公司生產，批號：BS0096)，TUNEL試劑盒(美國ROCHE生物科技公司生產，批號：11684817910)，Bcl-2抗體(美國Millpore公司生產，批號：AB1722)，Bax抗體(美國Millpore公司生產，批號：04-434)。

1.3實驗藥品 溫肺降濁方，由制附子20 g，黨參15 g，炙甘草10 g，干姜10 g，酒大黃10 g，田七10 g共6味中藥組成，(由江蘇江陰天江藥業有限公司提供，批號：1406033)。石杉堿甲片(浙江震元制藥有限公司生產，批號：H20033718)。頭孢羥氨芐甲氧芐啶膠囊(哈藥集團三精制藥諾捷有限責任公司生產，批號：H20056737)，用于造模術后預防感染。

1.4實驗方法

1.4.1VD模型大鼠制備 隨機從合格的大鼠抽出16只作為假手術組，其余104只大鼠進行VD模型大鼠的制備。參照Ni等〔2〕的雙側頸總動脈永久結扎(2-VO)法將大鼠雙側頸總動脈用4～0無菌蠶絲線永久性結扎制作VD動物模型。假手術組腹腔注射麻醉后行分離雙側頸總動脈手術操作，但不結扎，其余操作及術后處理與模型組相同。

1.4.2Morris水迷宮定位航行實驗 各組大鼠按第1、第2、第3、第4象限的順序，將大鼠面向池壁(大鼠頭部向上，以防溺水)依次放入水中，設計大鼠進駐平臺的時間(逃避潛伏期時間)為60 s，記錄其60 s內成功進駐平臺(大鼠找到平臺并滯留其上5 s為成功)所需時間(即逃避潛伏期)。如果大鼠在60 s內找不到平臺，讓它在平臺上停留10 s再取出來，且記錄大鼠逃避潛伏期時間為60 s。每只大鼠每天訓練4次(上、下午各2次)，連續5 d。取4個象限逃避潛伏期時間的均數作計算。

1.4.3造模成功的判定標準 參照趙憲林等〔3〕的VD模型大鼠篩選標準進行判定，即以假手術組大鼠逃避潛伏期時間的均值為參考值，計算模型組大鼠各鼠的平均逃避潛伏期與參考值之差占該鼠的平均逃避潛伏期時間的比例，該值>20%定為合格的VD大鼠。

1.4.4實驗分組 根據隨機數字表，本次實驗將合格的75只VD模型大鼠隨機分到模型組15只，溫肺降濁方低劑量組15只，溫肺降濁方中劑量組15只，溫肺降濁方高劑量組15只，石杉堿甲組15只。

1.4.5灌胃給藥 于造模后第15天開始灌胃給藥，大鼠灌胃藥物劑量的換算方法，均按人與大鼠體表面積系數比確定。給藥劑量以臨床人用藥等效劑量作為中劑量，溫肺降濁方低、中、高劑量組大鼠的給藥劑量分別為3.75、7.50、15.00 g/(kg·d)，石杉堿甲組給藥劑量為0.15 mg/(kg·d)，灌胃濃度每天按1 ml/100 g大鼠體重進行。其中假手術組及模型組均予相應體積的雙蒸水灌胃。所有大鼠灌胃給藥均為1次/d，共30 d。

1.4.6TUNEL染色 每組隨機取7只大鼠進行心臟灌注取腦，先后用0.9%生理鹽水和4%多聚甲醛進行灌注后，取全腦組織，分別裝入有4%多聚甲醛的標本瓶中固定，保存在4℃冰箱中，固定不少于24 h。①經固定后的腦組織，常規石蠟包埋，冠狀面連續切片，厚度約4 μm。②切片常規用二甲苯脫蠟，經各級乙醇至水洗。③用胃蛋白酶Pepsin孵育。④滴加50 μl的TUNEL反應混合溶液標記并進行孵育。⑤加入50～100 μl二氨基聯苯胺(DAB)底物溶液顯色。⑥再用蘇木素復染細胞核。⑦1%鹽酸酒精分化。⑧1%氨水反藍。⑨常規脫水，透明，封片。⑩在光學顯微鏡下，觀察大鼠海馬CA1區神經細胞凋亡情況，細胞凋亡表現為胞體呈三角形或不規則形，形態縮小，核固縮深染，細胞核中有藍褐色顆粒者為陽性凋亡細胞，而陰性神經元的胞核則不顯示成藍褐色。在每張切片同一區域中隨機選取5個互不重疊的視野進行觀察陽性細胞數和總細胞數，計算凋亡細胞指數(AI)，AI(%)=凋亡細胞數/總細胞數×100%。

1.4.7Western印跡實驗 將大鼠進行斷頭低溫新鮮取腦，在冰臺上快速分離出雙側海馬，立即置于2 ml EP管中，然后放入-80℃液氮中保存，各組大鼠取材完畢后轉至-80℃冰箱保存標本，為組織蛋白的提取做準備。①制備十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)。②樣品的變性及電泳。③凝膠轉膜及其檢測，恒流250 mA轉膜，在含有5%的脫脂奶粉的封閉液中封閉2 h。將封閉后的膜直接放入稀釋后的一抗工作液(Bcl-2、Bax及抗β-actin的抗體)中，4℃反應過夜。用1×PBST洗膜3次。將二抗(山羊抗兔)用1×PBST稀釋3 000倍；將洗滌后的一抗反應膜放入二抗工作液中作用90 min。再用1×PBST洗膜3次。④曝光及洗片。經顯影定影液顯色，根據條帶的亮度及背景情況可以再次選擇曝光時間進行二次曝光。用凝膠圖像處理系統分析目標帶的灰度值。用所測蛋白(Bcl-2、Bax)的灰度值分別與內參照β-actin的灰度值比較，所得的比值表示所測蛋白的相對表達量。

1.5統計學分析 采用SPSS17.0統計分析軟件，進行單因素方差分析。

2 結 果

2.1一般情況觀察 經過30 d藥物灌胃治療后，觀察到溫肺降濁方中、高劑量組和石杉堿甲組大鼠恢復至術前正常飲食，精神活動可，反應比較敏捷，毛發也較前潤澤，其中溫肺降濁方高劑量組大鼠反應較溫肺降濁方中劑量組、石杉堿甲組迅速，一有動靜即睜眼，跑到柵欄張望；而溫肺降濁方低劑量組大鼠只是稍許睜眼；模型組大鼠絕大多數在原地不動，反應遲鈍，目光呆滯，存在少食少飲，體重減輕，毛發枯黃無澤的表現；假手術組大鼠行為活動，進食及精神狀況等均正常，且性格好動，時常打斗。

2.2TUNEL結果 模型組海馬CA1區可見大量分布的陽性細胞，極少見有正常的神經細胞，其AI〔(64.75±2.02)%〕明顯高于假手術組〔(7.72±1.69)%〕、溫肺降濁方低、中、高劑量組〔(35.30±3.09)%、(23.61±3.02)%、(11.24±3.48%)〕和石杉堿甲組〔(17.03±2.61)%,均P<0.01〕；組間比較發現：溫肺降濁方三劑量組組間AI比較差異有統計學意義(P<0.01)；溫肺降濁方高劑量組與石杉堿甲組比較差異有統計學意義(P<0.01)；石杉堿甲組與溫肺降濁方中劑量組比較差異有統計學意義(P<0.01)；溫肺降濁方高劑量組與假手術組比較差異有統計學意義(P<0.05)。各藥物組中，以溫肺降濁方高劑量組抗VD大鼠海馬CA1區神經元凋亡的作用最為明顯，其次是石杉堿甲組，見圖1。

圖1 大鼠海馬CA1區病理改變(TUNEL染色，×400)

2.3各組海馬組織Bcl-2蛋白表達 模型組較假手術組Bcl-2蛋白表達明顯減少，差異有統計學意義(P<0.01)。石杉堿甲組、溫肺降濁方低、中、高劑量組與模型組比較，Bcl-2蛋白表達顯著增加(P<0.01)。組間比較發現：溫肺降濁方低、中、高劑量組三者組間Bcl-2蛋白表達比較差異有統計學意義(P<0.01)；溫肺降濁方高劑量組與石杉堿甲組比較差異有統計學意義(P<0.01)；石杉堿甲組與溫肺降濁方中劑量組比較差異有統計學意義；溫肺降濁方高劑量組與假手術組比較差異無統計學意義(P>0.05)。各藥物組中，以溫肺降濁方高劑量組增加Bcl-2蛋白表達的作用最為顯著。見表1，圖2。

2.4各組海馬組織Bax蛋白表達 模型組較假手術組Bax蛋白表達明顯增加，差異有統計學意義(P<0.01)。石杉堿甲組、溫肺降濁方低、中、高劑量組與模型組比較Bax蛋白表達顯著降低，差異均有統計學意義(P<0.01)。組間比較發現：溫肺降濁方低、中、高劑量組三者組間Bax蛋白表達比較差異有統計學意義(P<0.01)；溫肺降濁方高劑量組與假手術組、石杉堿甲組比較差異有統計學意義(P<0.01)；石杉堿甲組與溫肺降濁方中劑量組比較差異有統計學意義(P<0.01)。各藥物組中，以溫肺降濁方高劑量組抑制Bax蛋白表達的作用最為顯著。見表1，圖2。

表1 各組海馬組織Bcl-2、Bax蛋白表達比較

與假手術組比較：1)P<0.01;與模型組比較：2)P<0.01;與石杉堿甲組比較：3)P<0.01;與溫肺降濁方高劑量組比較：4)P<0.01;與溫肺降濁方低劑量組比較：5)P<0.01

1：假手術組；2：模型組；3：溫肺降濁方低劑量組；4：溫肺降濁方中劑量組；5：溫肺降濁方高劑量組；6：石杉堿甲組圖2 各組海馬組織Bcl-2、 Bax蛋白表達

3 討 論

海馬是大腦高級神經系統的重要結構組成之一，在學習和記憶功能中起著十分的重要作用〔4〕。研究表明，海馬各段解剖組織對缺血的易損傷性分別依次為CA1>CA2>CA3>齒狀回〔5〕。海馬CA1區錐體細胞發生的遲發性壞死(細胞凋亡)可能是缺血性相關腦血管疾病導致癡呆的主要原因〔6〕。海馬以CA1區與學習記憶及空間辨別的關系是最為密切的，故本研究選取海馬CA1區進行病理研究，結果表明模型組海馬CA1區神經元胞體縮小，核固縮深染，細胞結構層次紊亂，神經元大量凋亡、丟失，而溫肺降濁方低、中、高劑量組海馬CA1區神經元異常改變較模型組明顯減輕，可見VD的學習記憶障礙與海馬CA1區神經元凋亡有十分密切的關系。

細胞凋亡的病理機制十分復雜，凋亡過程的詳細機制目前尚不完全清楚，凋亡的發生既是凋亡相關基因表達的結果，又受許多內外因素的調節。在缺血缺氧的情況下，既可引起神經細胞的壞死，也可造成神經細胞的大量凋亡〔7〕。凋亡在缺血性神經細胞脫失中起重要的作用〔8〕，實驗研究〔9〕發現慢性缺血癡呆大鼠的海馬中有明顯的細胞凋亡發生，從而會導致嚴重的學習與記憶障礙。因壞死是具有不可逆轉性，而凋亡則具有可塑性，另外細胞凋亡的發生需要一定的時間，這就為VD的治療創造了很好的機會，并有助于發現藥物干預的新分子靶目標。細胞凋亡的最初標志是形態學上的變化，TUNEL法能準確地反映出細胞凋亡最典型的生物化學和形態學特點，對細胞凋亡的檢測有很強的特異性。在TUNEL實驗結果中，模型組大鼠出現大量成簇的神經元凋亡，神經元凋亡數目較各組明顯增多，而溫肺降濁方低、中、高劑量組對海馬CA1區神經元凋亡數目與模型組比較，均有不同程度減少，而且存在一定量效關系，以溫肺降濁方高劑量組的作用最為顯著，說明溫肺降濁方具有抑制細胞凋亡發生，保護神經元的作用。

Bax和Bcl-2均是Bcl-2家族的重要分子，Bax的作用與Bcl-2相反、相互拮抗，Bcl-2和Bax的表達強度決定著細胞的最終命運。當Bax過量表達則細胞凋亡，Bcl-2過量表達則細胞存活。Bax蛋白表達增加，細胞色素C自線粒體釋放，導致凋亡發生的一系列復雜的“瀑布”式反應，且提示細胞凋亡傾向增加，Bcl-2是重要的抗凋亡蛋白，Bcl-2的作用占優勢時，細胞色素C不釋放入胞質，線粒體凋亡路徑不起作用。Bcl-2水平升高提示細胞凋亡概率下降，反之細胞凋亡傾向則會增加〔10〕。研究認為，從分子水平層面促進Bcl-2蛋白的表達、抑制Bax蛋白的表達，可能是抑制神經細胞的調亡、避免腦缺血后VD發生的有效途徑之一〔11〕。

根據本實驗結果推斷，溫肺降濁方可通過調節凋亡相關因子Bcl-2、Bax蛋白的表達，從而增強Bcl-2抗凋亡作用，減輕Bax的促凋亡作用，進而抑制VD大鼠海馬神經元的凋亡，改善VD大鼠的學習記憶能力。