枸杞多糖對糖尿病大鼠視網膜caspase-3、Bcl-2和Bax表達的影響

王海彬 董志軍 郭立濤 石晶 董微麗

(承德醫學院附屬醫院眼科，河北 承德 067000)

糖尿病視網膜病變(DR)是糖尿病的一種嚴重的慢性并發癥，是造成患者失明的主要原因之一〔1〕。DR的病變范圍包括黃斑水腫，玻璃體腔出血與視網膜新生血管性青光眼，嚴重影響患者的視力。視網膜神經細胞不可逆凋亡是DR發病的直接原因。研究表明，糖尿病因高血糖激活機體的信號通路，導致體內活性氧增加，導致患者視網膜組織損傷與神經細胞凋亡〔2〕。枸杞多糖為茄科植物寧夏枸杞Lycium barbarum L.干燥成熟果實枸杞子的活性成分，具有抗氧化、抗腫瘤、調節神經、增強免疫等藥理作用〔3～7〕。研究表明，枸杞多糖能夠抑制糖尿病視網膜血管新生、減輕氧化應激反應及炎癥反應，從而減輕線粒體病理性變化，阻止神經細胞凋亡，對視網膜病變具有一定療效〔8～10〕。目前對枸杞多糖保護視網膜的作用機制尚未明確，對此，本研究通過觀察枸杞多糖對糖尿病視網膜病變大鼠模型視網膜細胞凋亡情況、視網膜含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)-3、Bcl-2、Bax mRNA與蛋白表達的影響，探討枸杞多糖對糖尿病視網膜病變的保護作用及其相關機制。

1 材料與方法

1.1動物 2月齡清潔級雄性健康SD大鼠60只，體重(180±20)g，購于河北省實驗動物中心，許可證號SCXK(冀)2013-0026，適應性喂養2 w。

1.2藥物 鏈脲佐菌素(STZ，Sigma 公司)，枸杞多糖(寧夏潤德枸杞產業有限公司)，葡萄糖測定試劑盒(北京北化康泰臨床試劑有限公司)，caspase-3、Bcl-2、Bax mRNA與蛋白質測定試劑盒(上海江萊生物科技有限公司)，細胞凋亡TUNEL檢測試劑盒(美國Roche公司)。

1.3儀器 血糖儀(美國Roche 公司)，熒光定量PCR 儀(美國賽默飛世爾科技有限公司)，電泳儀(北京六一儀器廠)，光學顯微鏡(日本Nikon公司)。

1.4實驗分組及糖尿病大鼠模型的建立 根據文獻方法〔11〕建立STZ糖尿病模型，大鼠禁食12 h后腹腔注射STZ 60 mg/kg。72 h后，取尾靜脈血測血糖，以血糖≥16.7 mmol/L為糖尿病模型成功標準〔12〕。取造模成功大鼠隨機分為模型組、枸杞多糖低、中、高劑量組，未造模大鼠作為對照組，每組12只。枸杞多糖低、中、高濃度組大鼠分別灌胃給予50 mg/kg、100 mg/kg、200 mg/kg枸杞多糖干預，對照組與模型組大鼠給予等體積的生理鹽水，連續給藥12 w。

1.5蘇木素-伊紅(HE)染色 各組大鼠處死后取眼球，置于多聚甲醛固定，梯度乙醇脫水，采用二甲苯30 min透明，置于石蠟中包埋，采用連續切片，切片厚4 μm。脫蠟后，蘇木素染色3 min，沖洗后，采用1%鹽酸酒精分化2 s，自來水沖洗，分別至于梯度乙醇脫水，伊紅染色2 min，95%酒精分色，無水酒精脫水，二甲苯15 min透明，中性樹膠封片。置于光學顯微鏡下觀察。

1.6TUNEL染色檢測神經節細胞凋亡 取大鼠眼球石蠟切片，對切片進行TUNEL染色，60℃恒溫烤片120 min，脫蠟后，Proteinase K工作液37℃消化處理30 min，加入TUNEL反應混合物50 μl孵育處理60 min，過氧化物酶轉化劑37℃孵育處理30 min，二氨基聯苯胺(DAB)顯色，蘇木素復染，梯度乙醇脫水，二甲苯15 min透明，中性樹膠封片。置于光學顯微鏡下觀察，凋亡細胞的陽性細胞核呈棕褐色。計算凋亡指數(AI)，AI=陽性細胞數/神經細胞總數。

1.7RT-PCR檢測視網膜caspase-3、Bcl-2、Bax mRNA表達水平 取各組大鼠眼球，剝離視網膜，采用TRIzol法抽提總RNA，通過逆轉錄制備cDNA，聚合酶鏈反應(PCR)擴增cDNA。反應條件：95℃預變性2 min，95℃變性15 s，60℃退火30 s，72℃延伸45 s。caspase-3、Bcl-2、Bax引物序列：caspase-3上游5′-AATTCAAGGGACGGGTCATG-3′，下游5′-GCTTGTGCGCGTACAGTTTC-3′(164 bp)；Bcl-2上游5′-CAAGAATGCAAAGCACATCC-3′，下游5′-ATCCCAGCCTCCGTTATCC-3′(255 bp)；Bax上游5′-TGGAGCTGCAGAGGATGATT-3′，下游5′-CAGGGCCTTGAGCACCACTT-3′(231 bp)；內參β-actin上游5′-CCTGCTTGCTGATCCACA-3′，下游5′-CTGACCGAGCGTGGCTAC-3′(115 bp)。采用瓊脂糖凝膠電泳，Bio-Rad凝膠成像系統進行灰度掃描，分別記錄caspase-3、Bcl-2、Bax及相應β-actin的光密度值(A)，以β-actin為內參進行半定量分析caspase-3、Bcl-2、Bax mRNA表達。

1.8Western印跡法檢測視網膜caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表達 取各組大鼠眼球，剝離視網膜組織。對視網膜組織細胞總蛋白進行RIPA裂解提取，并進行蛋白定量檢測，變性，上樣，電泳，轉至聚偏氟乙烯膜，采用質量分數5%的脫脂奶粉封閉，加入相應抗體(1%脫脂奶粉稀釋作為一抗和二抗，一抗效價比1：300，二抗效價比1∶1 000)。Ipwin 32圖像分析軟件分析，測定波長為450 nm，分別計算caspase-3、Bcl-2、Bax條帶與β-actin條帶的灰度比值，以caspase-3/β-actin、Bcl-2/β-actin、Bax/β-actin比值代表相應蛋白的表達水平。

1.9統計學方法 采用SPSS17.0軟件進行單因素方差分析、t檢驗。

2 結 果

2.1HE染色結果 對照組大鼠視網膜膜盤結構清晰，各層細胞排列整齊；模型組大鼠視網膜部分細胞出現水腫，層次模糊，排列稀疏紊亂，膜盤間隙出現空泡樣，核染色質密集，視網膜神經節細胞豐富；枸杞多糖低、中、高濃度組大鼠視網膜細胞水腫與模型組比較減輕，細胞層次清晰，排列整齊，神經節細胞數量明顯減少，高濃度組大鼠視網膜改善情況顯著優于中、低濃度組。見圖1。

圖1 各組視網膜HE染色結果(×400)

2.2各組視網膜神經細胞凋亡檢測結果 對照組視網膜未發現陽性細胞；模型組視網膜大量細胞呈棕褐色，細胞AI明顯高于對照組(P<0.05)；枸杞多糖低濃度組視網膜發現部分陽性細胞；枸杞多糖中、高濃度組視網膜陽性細胞數和細胞AI明顯低于模型組(P<0.05)。枸杞多糖中、高濃度組視網膜細胞AI明顯低于枸杞多糖低濃度組(P<0.05)；枸杞多糖高濃度組大鼠視網膜陽性細胞數顯著低于枸杞多糖中濃度組(P<0.05)。見圖2、表1。

2.3各組視網膜caspase-3、Bcl-2、Bax mRNA表達檢測結果 與對照組比較，模型組視網膜caspase-3、Bax mRNA表達水平均明顯升高，Bcl-2 mRNA表達水平明顯降低，Bcl-2/Bax明顯降低(P<0.05)。與模型組比較，枸杞多糖低、中、高濃度組caspase-3、Bax mRNA表達水平明顯降低，Bcl-2 mRNA表達水平明顯升高，Bcl-2/Bax明顯上調(P<0.05)。枸杞多糖高、中濃度組caspase-3、Bax mRNA表達水平顯著低于枸杞多糖低濃度組(P<0.05)，Bcl-2 mRNA表達水平及Bcl-2/Bax顯著高于枸杞多糖低濃度組(P<0.05)。見表1。

圖2 各組視網膜TUNEL染色結果(×400)

組別nAIcaspase-3Bcl-2BaxBcl-2/Bax對照組120.021±0.0050.125±0.0170.779±0.1040.306±0.0332.546±0.435模型組80.206±0.0861)0.630±0.0521)0.317±0.0591)0.711±0.1121)0.446±0.0331)枸杞含糖低濃度組100.187±0.0230.459±0.0642)0.557±0.0562)0.652±0.1062)0.854±0.1161)枸杞含糖中濃度組120.089±0.0242)3)0.300±0.0312)3)0.648±0.0822)3)0.490±0.0642)3)1.322±0.1352)3)枸杞含糖高濃度組120.063±0.0102)4)0.268±0.0442)3)0.712±0.0992)3)0.383±0.0372)3)1.859±0.1412)3)

與對照組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05；與枸杞多糖低濃度組比較：3)P<0.05；枸杞多糖中濃度組比較：4)P<0.05；下表同

2.4各組視網膜caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表達檢測結果 與對照組比較，模型組視網膜caspase-3、Bax蛋白表達水平明顯升高，Bcl-2蛋白表達水平、Bcl-2/Bax明顯降低(P<0.05)。與模型組比較，枸杞多糖低、中、高濃度組caspase-3、Bax蛋白表達水平明顯降低，Bcl-2蛋白表達水平明顯升高，Bcl-2/Bax顯著上調(P<0.05)。枸杞多糖高、中濃度組caspase-3和Bax蛋白表達較枸杞多糖低濃度組明顯降低，Bcl-2蛋白表達水平及Bcl-2/Bax明顯高于枸杞多糖低濃度組(P<0.05)。見表2、圖3。

表2 各組視網膜caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表達水平

1～5：對照組、模型組、枸杞多糖低濃度組、枸杞多糖中濃度組、枸杞多糖高濃度組圖3 各組視網膜caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表達

3 討 論

隨著糖尿病的發病率不斷提高，DR作為糖尿病最常見并發癥之一，是引起人類致盲的眼病，其發病率也伴隨著糖尿病發病率的增高不斷上升〔13〕。DR主要發生機制包括多元醇通路激活、晚期糖基化終末產物(AGEs)增加、蛋白激酶(PK)C激活與氮基己糖四條經典通路途徑，最終導致視網膜神經細胞凋亡〔14〕。Caspase-3是Caspase家族目前已知的最重要的凋亡執行蛋白〔15〕。Bcl-2與Bax在視網膜病變神經細胞凋亡的過程中起重要作用，Bcl-2是目前已知的最強凋亡抑制因子，具有阻礙促凋亡基因信號傳遞的作用，Bax則屬于促凋亡因子，二者形成異源二聚體Bcl-2/Bax抑制細胞凋亡，Bcl-2/Bax降低時更容易導致機體內細胞死亡〔16〕。

枸杞子性甘味平，歸肝腎經，具有滋補肝腎、益精抗衰、潤肺明目、強筋健骨的功效，枸杞多糖為枸杞子的主要活性成分。藥理學研究表明，枸杞多糖能夠提高機體超氧化物歧化酶(SOD)等抗氧化因子表達，降低機體丙二醛(MDA)含量水平，增強機體抗氧化能力及清除氧化產物的能力，防止氧化應激損傷胰島細胞并促進其再生，起降糖作用〔17〕。枸杞多糖對DR具有改善作用，能夠通過延遲整流鉀電流的幅度防止神經細胞凋亡，并且可通過拮抗糖基化終產物的增殖毒性，降低視網膜細胞因子的表達，減少細胞損傷〔18，19〕。通過本研究病理學檢測發現，糖尿病視網膜病變導致細胞水腫、膜盤間隙增大等，并且會引起神經細胞凋亡的發生。枸杞多糖具有改善視網膜細胞水腫，保護視網膜神經細胞凋亡的作用。枸杞多糖通過降低糖尿病大鼠視網膜caspase-3、Bax mRNA與蛋白的表達水平，提高凋亡抑制因子Bcl-2 mRNA和蛋白的表達水平，上調Bcl-2/Bax，防止視網膜神經細胞凋亡，這可能是枸杞多糖對DR的保護作用機制。