白細胞介素-22結合蛋白在腸炎相關性結直腸癌發病中的作用

葉華 涂云

(1廣東醫科大學廣東省天然藥物研究與開發重點實驗室，廣東 湛江 524023；2湛江中心人民醫院)

結直腸癌(CRC)的發生與慢性腸道炎癥有關，最常見的是炎癥性腸病(IBD)，包括潰瘍性結腸炎(UC)和克羅恩病(CD)。炎癥性腸病向CRC發展的過程中，炎癥因子發揮重要作用。白細胞介素(IL)-22能夠促進IBD患者腸黏膜愈合，然而，如果不加控制，它可以導致腸道癌癥的發生〔1,2〕。IL-22結合蛋白(BP)能夠特異性結合IL-22，使IL-22不能與IL-22受體(IL-22R)1結合發揮作用〔3〕。然而，IL-22BP在腸炎相關性結直腸癌(CAC)發病中的作用還不清楚。因此，筆者建立了小鼠腸炎相關性結直腸癌模型，研究IL-22BP的作用。

1 材料與方法

1.1實驗動物 SPF級雄性C57BL/6小鼠，6～7周齡，體重(20±2)g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，合格證號：SCXK(京)2012-0001。

1.2試劑及儀器 氧化偶氮甲烷(AOM)購于美國Sigma公司，葡聚糖硫酸鈉(DSS)(MW:36 000～50 000 D)購自美國MP Bio公司。PCNA和Ki-67單克隆抗體購自北京中杉金橋生物技術有限公司。兔抗小鼠p-STAT3購自美國CST公司，p-STAT3酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒購自Abnova公司。聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)蛋白濃度測定試劑盒和十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)配制試劑盒購自碧云天生物科技研究所。小鼠隱血試劑盒購自南京建成生物工程研究所。組織包埋機(武漢俊杰電子有限公司)，組織切片機RM2235(德國LEICA公司)，穩壓穩流電泳儀和垂直板電泳槽(美國Bio-Rad公司)。

1.3實驗方法

1.3.1小鼠的分組和處理 將30只小鼠隨機分為空白組、模型組和IL-22BP組。除空白組以外，各組給予生理鹽水配制的AOM溶液(12 mg/kg)腹腔注射1次，觀察1 w后，模型組和IL-22BP組先給予2% DSS溶液自由飲用5 d，再換普通潔凈水飲用16 d，此21 d為1個循環，共4個循環；空白組則腹腔注射等量的生理鹽水1次，整個實驗期間一直飲用普通潔凈水。造模于第120天結束。從每個循環的第15天開始，IL-22 BP組腹腔注射0.2 mg/kg IL-22BP，每2天注射1次，重復4個循環。

1.3.2一般情況和成瘤情況觀察 造模期間，每天觀察小鼠進食量、精神狀態、活動情況和毛發亮澤度等，給DSS前1 d及后1 d分別記錄小鼠體重、大便性狀及便血情況，按Cooper法〔4〕進行小鼠疾病活動指數(DAI)評分。第120天處死小鼠，取盲腸至肛門段結腸，量取長度，并觀察結腸大體形態及計數腫瘤個數。

1.3.3免疫組化法檢測結直腸腫瘤組織PCNA和Ki-67表達 PCNA和Ki-67按照1∶100稀釋，采用免疫組化SP法觀察PCNA和Ki-67陽性細胞的定位及變化情況，Image-Pro Plus軟件分析平均光密度。

1.3.4qPCR法檢測結直腸腫瘤組織STAT3 mRNA表達 采用Trizol試劑提取結腸組織的總RNA，根據兩步法逆轉錄試劑盒說明合成cDNA，qPCR擴增目的基因和內參基因，qPCR條件為95℃ 預變性1 min，95℃變性10 s，60℃退火延伸40 s，共40個循環。

1.3.5ELISA檢測結直腸腫瘤組織p-STAT3表達 將待測組織與低溫生理鹽水按照1∶9放入勻漿器充分研磨后，于4℃以5 000 r/min離心5 min，取上清液按ELISA試劑盒要求操作，于450 nm檢測吸光度。

1.4統計學方法 應用SPSS20.0統計軟件進行單因素方差分析。

2 結 果

2.1小鼠一般情況 實驗過程中，模型組和IL-22BP組小鼠均出現不同程度消瘦、厭食、脫毛、血便等表現，肉眼比較未發現兩組有明顯差異。與空白組相比，模型組小鼠在飲用DSS后體重逐漸下降；與模型組相比，IL-22BP組小鼠前期體重變化沒有明顯差異，后期體重下降情況有所緩解。DAI評分方面，IL-22BP組小鼠前期與模型組基本一致，80 d后DAI評分較模型組相比有所升高(圖1)。

2.2小鼠成瘤情況 收集各組小組結直腸標本，縱向剖開，空白組小鼠腸黏膜完整光滑，模型組(10只鼠均成瘤)和IL-22BP組(9只鼠成瘤)小鼠結直腸可見不同程度充血水腫，有大小不一的腫瘤出現在腸壁的黏膜面，凸向腸腔，少數呈片狀隆起，多位于近肛門側。與模型組相比，IL-22BP組小鼠腫瘤數量明顯降低(16個 vs 36個)，小鼠平均腫瘤數目由(3.6±1.24)個減少為(1.6±0.97)個，差異有統計學意義(P<0.01)。

2.3小鼠結直腸組織PCNA和Ki-67的表達 空白組小鼠結直腸細胞染色較淺，PCNA和Ki-67中表達較少；模型組和IL-22BP組PCNA和Ki-67染色明顯增強，范圍較大(圖2)?？瞻捉M、模型組和IL-22BP組PCNA平均光密度值分別為0.39±0.06、0.70±0.13和0.61±0.08，IL-22BP組與模型組顯著高于空白組(P<0.05)，IL-22BP組顯著低于模型組(P<0.05)；空白組、模型組和IL-22BP組Ki-67平均光密度值分別為0.48±0.08、0.81±0.16和0.64±0.11，IL-22BP組與模型組顯著高于空白組(P<0.05)，IL-22BP組顯著低于模型組(P<0.01)。

2.4小鼠結直腸腫瘤組織STAT3 mRNA和p-STAT3表達的表達 與空白組相比，模型組小鼠結直腸腫瘤組織STAT3 mRNA和p-STAT3表達明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)；與模型組相比，IL-22BP組STAT3 mRNA和p-STAT3水平均顯著降低(P<0.01)，表明腹腔注射IL-22BP可以下調STAT3 mRNA和p-STAT3水平。見表1。

表1 小鼠結直腸腫瘤組織STAT3 mRNA和p-STAT3水平

與空白組比較:1)P<0.01；與模型組比較:2)P<0.01

3 討 論

IL-22BP是IL-22的作用受體靶標，是一種可溶性Ⅱ類細胞因子受體，能夠特異性靶向結合IL-22，結合過程迅速而且親和力強，是IL-22與IL-22R1結合強度的50～1 000倍，因此可以阻止IL-22與IL-22R1結合，抑制IL-22的活性〔5〕。IL-22是IL-10家族的成員之一，具有促進上皮細胞增殖、分化、遷移，抑制細胞凋亡，加快上皮細胞損傷修復的作用〔6〕。近年多項研究顯示IL-22過表達與結直腸癌、肝癌、胃癌等多種腫瘤的發生發展有密切關系〔7～9〕。Trifari等〔10〕發現腸道炎癥可上調IL-22表達，下調IL-22BP表達，從而促進結直腸癌的發生。PCNA是真核細胞DNA合成所必需的一種核蛋白，其表達量在G1期逐漸增加，S期達最高峰，在G2/M期則逐漸減少〔11〕；Ki-67是一種存在于增殖細胞中核抗原，其表達水平愈高表明細胞增殖愈活躍〔12〕；檢測PCNA和Ki-67的表達可以反映結直腸細胞的增殖活性。本文結果提示給予IL-22BP可以抑制結直腸癌細胞的增殖，進而抑制腫瘤的發生發展。

STAT3可通過炎癥介質，啟動細胞外信號，調控腫瘤細胞和免疫細胞等的生物學行為，被認為是慢性炎癥促進腫瘤和腫瘤相關性炎癥形成過程中不可缺少的關鍵分子〔13〕。研究表明，IL-6、IL-22等炎癥因子可以直接與細胞表面的相應受體結合，啟動細胞內酪氨酸激酶磷酸化級聯反應。在JAK2、MAPK等激酶的作用下，活化成為磷酸化的p-STAT3，進而誘導多種與細胞增殖、分化、凋亡和血管生成等生物學行為密切相關的下游靶基因表達，如Bcl-2、Cyclin-D1、VEGF等，促進結腸癌、肝癌等腫瘤的發生發展〔14，15〕。本研究結果顯示，給予IL-22BP可以降低STAT3 mRNA水平，抑制p-STAT3表達，這可能是IL-22BP抑制腸炎相關性結直腸癌的作用機制之一。但IL-22BP的這一效應是直接作用于STAT3還是通過抑制IL-22來實現的，尚有待進一步研究。