TMPRSS2-ERG融合基因檢測(cè)在前列腺癌診斷中的臨床價(jià)值

徐歡 習(xí)小慶 鐘德平 鄭增斌

(1上饒市人民醫(yī)院泌尿外科，江西 上饒 334000；2南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院泌尿外科)

前列腺癌是一種男性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，在我國(guó)因男性人口平均年齡的增長(zhǎng)、泌尿系結(jié)石、前列腺增生等相關(guān)疾病發(fā)生率上升，煙草泛濫，生活中致癌危險(xiǎn)因素的增多，前列腺癌的發(fā)生率快速上升〔1〕。前列腺癌診斷方法包括體格檢查、影像學(xué)檢查、標(biāo)志物檢測(cè)，近年來(lái)基因檢測(cè)在惡性腫瘤診斷中的價(jià)值越來(lái)越受到重視，相較于其他診斷方法，可以實(shí)現(xiàn)量化分析，特異性更強(qiáng)〔2〕。有報(bào)道顯示，TMPRSS2-ERG基因融合在前列腺癌發(fā)生中扮演了重要角色，可能是癌變的先發(fā)事件〔3〕。本研究評(píng)價(jià)TMPRSS2-ERG融合基因檢測(cè)在前列腺癌診斷中的臨床價(jià)值。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 2010年10月至2018年10月上饒市人民醫(yī)院泌尿外科診治的15例前列腺癌手術(shù)患者為腫瘤組，年齡54～85歲，平均(67.8±2.5)歲。良性前列腺增生患者15例為增生組，年齡54～83歲，平均(67.4±2.3)歲。兩組年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.24，P>0.05)。納入標(biāo)準(zhǔn)：①最終經(jīng)過(guò)病理檢查確診，腫瘤樣本參照Gleason指數(shù)分類(lèi)細(xì)胞腫瘤分期系統(tǒng)(TNM)分類(lèi)診斷；②組織保存完好；③在手術(shù)前，未進(jìn)行放化療；④年齡≥60歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：①組織樣本質(zhì)量差，無(wú)法進(jìn)行基因檢測(cè)；②術(shù)前輔助放化療。

1.2儀器與試劑 普通冰箱，丹麥 Termobrite S500 原位雜交儀，愛(ài)特爾HSX-250恒溫水浴鍋，日本 XW-80A旋渦混合器，日本 OLYMPUS BX51熒光顯微鏡，湖南湘儀MINI-10K迷你離心機(jī)，北京SQX-4-CP FISH分析軟件，湖北泰維 R138型切片機(jī)，TEC2602烤片機(jī)，移液器。試劑包括二甲苯、甲醇、IGH雙色基因探針、ATM單色基因探針、乙醇溶液、去離子水、SSC緩沖液、變性液(70%甲酰胺/2×SSC，pH7.0～8.0)、洗滌液等。

1.3標(biāo)本處理 采用4%中性甲醛固定，梯度乙醇脫水、二甲苯透明，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片厚度3 μm，二甲苯和梯度酒精水化，進(jìn)行蘇木素-伊紅(HE)染色、FISH檢測(cè)。標(biāo)本都采用甲醛溶液保存，在醫(yī)院按照常規(guī)的病理檢查、HE染色、免疫組化分析，常規(guī)方法無(wú)法診斷的對(duì)象，進(jìn)行FISH檢測(cè)。本文選擇符合納入、排除標(biāo)準(zhǔn)的樣本。對(duì)于選擇的樣本，將病理切片采用二甲苯脫水、脫蠟2次，每次10 min，而后浸入到100%乙醇，5 min，而后梯度乙醇脫水。將組織切片浸入到去離子水，3 min，拭去多余的水分。90℃去離子水處理切片，30 min。將切片浸入到蛋白酶K消化液，37℃孵化，30 min，再使用2×SSC緩沖液，前后2次，每次10 min。常溫下，1%甲醛溶液處理，10 min，采用梯度乙醇脫水，自然干燥，加熱至56℃。

1.4融合基因檢測(cè) 采用熒光原文雜交檢測(cè)法檢測(cè)，在暗處將10 μl探針混合物(探針2 μl+雜交緩沖液8 μl)加至相應(yīng)的玻片雜交區(qū)域，覆蓋蓋玻片并封片,雜交儀變性雜交過(guò)夜；雜交條件42℃16 h以上。雜交后用2×SSC和0.01%乙基苯基聚乙二醇(NP-40)/2×SSC洗滌液漂洗10 min，置70%乙醇中漂洗3 min；暗處自然干燥。將10 μl的4,6-聯(lián)脒-2-基吲哚二鹽酸鹽復(fù)染劑滴加在標(biāo)記的雜交區(qū)域位置，并蓋上蓋玻片，暗處放置20 min后在熒光顯微鏡下觀察。使用熒光顯微鏡觀察樣本，評(píng)價(jià)圖像的質(zhì)量，選擇其中成像理想的區(qū)域，采用DP11顯微照相機(jī)對(duì)區(qū)域拍攝，VT FISH軟件處理數(shù)據(jù)，保存圖片、數(shù)據(jù)。VT FISH軟件通過(guò)分析熒光信號(hào)的不同顏色，分析細(xì)胞的基因表達(dá)信號(hào)強(qiáng)度，判斷是否為正常細(xì)胞或異常細(xì)胞，計(jì)算不同細(xì)胞的比重。選擇TMPRSS2-ERG、TMPRSS2-ETV1，TMPRSS2-ETV4三種探針，每組探針檢測(cè)100個(gè)細(xì)胞，計(jì)算檢測(cè)閾值，閾值=平均值(M)+3×標(biāo)準(zhǔn)差(SD)。

1.5觀察指標(biāo) 兩組FISH檢測(cè)結(jié)果，融合基因診斷前列腺癌的靈敏度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值、符合率。對(duì)比前列腺癌TMPRSS2-ERG融合基因陽(yáng)性對(duì)象、陰性對(duì)象的血清PSA水平、前列腺Gleason評(píng)分水平。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS16.0軟件處理，計(jì)算TMPRSS2-ERG、TMPRSS2-ETV1、TMPRSS2-ETV4三組融合基因的閾值，對(duì)比兩組融合基因檢測(cè)結(jié)果，數(shù)據(jù)比較進(jìn)行χ2檢驗(yàn)或確切概率法，血清PSA水平、前列腺Gleason評(píng)分水平非正態(tài)分布，采用中位數(shù)與四分位距M(P25，P75)表示，非參數(shù)檢驗(yàn)，P<0.05時(shí)表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1基因融合檢測(cè)結(jié)果 兩組TMPRSS2-ERG融合基因陽(yáng)性及陰性分布、TMPRSS2-ETS融合基因陽(yáng)性及陰性分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。兩組TMPRSS2-ETV1融合、TMPRSS2-ETV4融合基因陽(yáng)性及陰性分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

2.2診斷效用 TMPRSS2-ERG融合基因診斷前列腺的靈敏度、符合率顯著低于TMPRSS2-ETS融合基因(P<0.05)。見(jiàn)表2。

2.3前列腺癌TMPRSS2-ERG融合基因臨床特征 前列腺癌TMPRSS2-ERG融合基因陽(yáng)性對(duì)象的PSA顯著高于陰性對(duì)象，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，陽(yáng)性及陰性對(duì)象的Gleason評(píng)分差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表3。

表1 兩組TMPRSS2四種融合基因檢測(cè)結(jié)果(n,n=15)

表2 TMPRSS2-ERG融合基因、TMPRSS2-ETS融合基因診斷前列腺癌效用對(duì)比(%)

與TMPRSS2-ERG相比:1)P<0.05

表3 前列腺癌TMPRSS2-ERG融合基因陽(yáng)性及陰性對(duì)象PSA、Gleason評(píng)分對(duì)比〔M(P25，P75)〕

與陰性相比:1)P<0.05

3 討 論

ERG基因主要包括調(diào)控生長(zhǎng)因子及其受體、參與信號(hào)傳導(dǎo)及細(xì)胞周期相關(guān)基因調(diào)控，調(diào)節(jié)造血系統(tǒng)發(fā)育與分化，ERG基因與白血病、惡性腫瘤發(fā)生關(guān)系密切〔3〕。TMPRSS2基因結(jié)構(gòu)集中在前列腺基底細(xì)胞、前列腺癌細(xì)胞中。因此TMPRSS2-ERG融合基因與前列腺基底細(xì)胞惡性病變關(guān)系密切。TMPRSS2-ERG是前列腺癌常見(jiàn)的基因融合類(lèi)型，T-E融合基因通過(guò)與雄激素受體、依賴(lài)蛋白激酶催化亞基(DNA-PKcs)、核因子κB、含半胱氨酸分泌蛋白3的相互作用，誘發(fā)前列腺癌〔4〕。

本研究顯示，TMPRSS2-ERG、TMPRSS2-ETS融合基因在良性前列腺疾病、前列腺癌中的分布存在顯著差異。本文采用的病理樣本檢測(cè)基因，理論上更能反映融合基因與前列腺病變之間的關(guān)系，良性惡性對(duì)象融合基因差異應(yīng)相較于尿液、血液檢測(cè)更為顯著。有報(bào)道顯示兩種疾病的TMPRSS2-ETV1、TMPRSS2-ETV4融合基因異常率也存在顯著的差異，這可能與本研究中納入對(duì)象例數(shù)較少、研究方法差異有關(guān)〔5〕。有報(bào)道顯示，檢測(cè)血清中TMPRSS2相關(guān)融合基因也可以輔助診斷前列腺癌，但是不同檢測(cè)方法顯然會(huì)影響檢測(cè)的結(jié)果。 不同文獻(xiàn)報(bào)道的前列腺癌TMPRSS2-ERG表達(dá)存在較大的差異，發(fā)生率為40%～80%〔6〕。本研究中前列腺癌對(duì)象為53.3%，處于正常水平，T-E融合基因在少數(shù)病例中會(huì)產(chǎn)生融合蛋白，同時(shí)產(chǎn)生序列時(shí)間短，不參與生物學(xué)活動(dòng)，可以忽略。反映了TMPRSS2-ERG融合基因可能與臨床特征有關(guān)，不同研究中的前列腺癌發(fā)生機(jī)制、流行病學(xué)存在差異，從而導(dǎo)致T-E融合基因異常率存在差異。本研究還發(fā)現(xiàn)，前列腺癌、良性前列腺增生對(duì)象TMPRSS2-ETS融合基因陽(yáng)性及陰性分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且這種差異較TMPRSS2-ERG融合更為顯著，但是有關(guān)于該基因融合的研究非常少，今后需要進(jìn)一步分析該融合在前列腺癌發(fā)生中的起作用機(jī)制。

本研究TMPRSS2-ERG陽(yáng)性對(duì)象的PSA高于陰性對(duì)象，與其他文獻(xiàn)〔7〕報(bào)道的結(jié)果并不一致，這可能與納入樣本PSA檢測(cè)的質(zhì)控水平有關(guān)，PSA容易受到前列腺炎癥活動(dòng)影響。本研究未得出陽(yáng)性及陰性對(duì)象的Gleason評(píng)分差異顯著的結(jié)論，相關(guān)文獻(xiàn)〔8〕報(bào)道TMPRSS2-ERG融合基因與Gleason評(píng)分的關(guān)系結(jié)論存在較大的差異，這與流行病學(xué)特征存在差異有關(guān)，反映了TMPRSS2-ERG融合基因與前列腺癌復(fù)雜關(guān)系。TMPRSS2-ERG融合基因異常可能是前列腺癌的始動(dòng)因素，即在惡性突變中可能發(fā)揮了關(guān)鍵的作用，但是在腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展過(guò)程中的作用可能并不強(qiáng)。有文獻(xiàn)〔9〕報(bào)道顯示，TMPRSS2-ERG融合基因異常并不是前列腺癌發(fā)生的必要條件，即其靈敏度相對(duì)較低，特異性相對(duì)較高，可以達(dá)到100%，可以降低假陽(yáng)性率。有關(guān)于前列腺癌TMPRSS2-ERG融合基因陽(yáng)性的影響因素研究較少，從國(guó)內(nèi)外研究來(lái)看，存在顯著人種差異，若能結(jié)合因素分析，可以更好地提升TMPRSS2-ERG融合基因診斷前列腺癌價(jià)值。

本研究?jī)H對(duì)病理組織中的融合基因進(jìn)行檢測(cè)，而想要獲得病理組織，便必須進(jìn)行手術(shù)或活檢，TMPRSS2-ERG融合基因檢測(cè)可能無(wú)法作為活檢的依據(jù)，而是作為活檢病理檢查的輔助指標(biāo)，這削弱了TMPRSS2-ERG融合基因檢測(cè)的價(jià)值。目前許多基因檢測(cè)都陷入了這樣的困境，即許多結(jié)果都是基于病理組織而得出的，無(wú)法作為活檢適應(yīng)證依據(jù)。而目前前列腺癌篩查診斷中活檢存在過(guò)度的風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)于PSA陽(yáng)性的對(duì)象活檢率居高不下，因此需控制不必要的活檢。從這一角度來(lái)看，今后需要開(kāi)展血液、尿液TMPRSS2-ERG融合基因檢測(cè)研究，以發(fā)揮TMPRSS2-ERG融合基因檢測(cè)強(qiáng)特異性的優(yōu)勢(shì)，與血清PSA檢測(cè)一起指導(dǎo)活檢，排除PSA假陽(yáng)性的風(fēng)險(xiǎn)，避免不必要的活檢。近年來(lái)，有學(xué)者嘗試采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)尿液中的T-E融合基因，減少了活檢，直接消除了患者活檢產(chǎn)生的緊張情緒，這種非侵入性檢測(cè)更易被接受〔10〕。

TMPRSS2-ERG融合基因檢測(cè)在前列腺癌診斷中有一點(diǎn)的價(jià)值，盡管診斷效用不如TMPRSS2-ETS融合基因，但是可以進(jìn)一步評(píng)估血清PSA檢測(cè)結(jié)果，配合其他檢查評(píng)估疾病惡性風(fēng)險(xiǎn)。今后需要探索尿液TMPRSS2-ERG融合基因檢測(cè)方法，以作為篩查技術(shù)，指導(dǎo)活檢，同時(shí)還可以作為疑難病例診斷的證據(jù)，避免誤診。