病毒巨噬細胞炎癥蛋白Ⅱ對293T細胞APOBEC3G表達的影響

鄭國霞 劉如錦 齊燕 王小波 閆玉濤 譚曉華 楊磊

杭州師范大學醫學院 310036

人獲得性免疫缺陷病毒（HIV）感染和艾滋?。ˋIDS）的傳播流行嚴重威脅著人類健康。研究發現，一些具較強抑制HIV-1感染功能的天然免疫因子如載脂蛋白B mRNA 編輯酶催化多肽樣蛋白3G（APOBEC3G），其表達水平與HIV-1 感染和疾病進展相關［1-2］。在細胞水平上，增加 APOBEC3G 表達量能有效抑制HIV-1 感染［3］。有研究顯示，干擾素α（IFN-α）可以明顯誘導APOBEC3G的表達［4-6］。經典的 IFN-α 誘導 APOBEC3G 轉錄途徑是，STAT1：STAT2 異源二聚體同干擾素調節因子（IRF）9 形成復合體，該復合體再結合到IFN應答相關基因啟動子的順式反應元件上（ISRE）［4］。Rose 等［7］的研究表明，在永生化的CD4+T細胞系，佛波酯可以通過PKCа/MEK/ERK 途徑誘導 APOBEC3G 表達。Kaposi 肉瘤（Kaposi′s sarcoma，KS）是 AIDS 患者最常見的并發癥及死因，KS 相關病毒（KSHV）是KS的病原。研究發現［7-8］，KSHV K4 基因編碼的病毒巨噬細胞炎癥蛋白Ⅱ（vMIP-Ⅱ）能封閉HIV 輔助受體，具有抗HIV感染的功能。Cherqui等［9］用基因芯片篩選到轉染vMIP-Ⅱ基因后的人臍靜脈內皮細胞中APOBEC3G 上調了8.70 倍。我們在預實驗中采用同樣的基因芯片篩選KS患者腫瘤組織中差異表達基因，也發現APOBEC3G 表達上調。因此，推測vMIP-Ⅱ可能通過激活APOBEC3G 表達來抵抗HIV 感染。本研究探討vMIP-Ⅱ對APOBEC3G 表達的影響，初步探討其調控機制。

材料與方法

一、材料

胎牛血清白蛋白（以色列Biological Industries公司）。綠色熒光蛋白質粒pEGFP-N3由北京大學醫學院惠贈。pEGFP-N3-K4質粒［中美泰和生物技術（北京）有限公司］，螢火蟲熒光素酶報告基因（pGL3）質粒（上海捷瑞生物工程有限公司），海腎熒光素酶質粒（美國Promega 公司）。胎牛血清（FBS）、DMEM培養基（澳洲HyClone公司）。IFN-α儲存液（美國Thermo 公司），U0126（ERK 信號通路抑制劑）干粉、AG490（JAK/STAT信號通路抑制劑）干粉（美國Sigma 公司）。β 肌動蛋白抗體（德國Cell Signaling Technology 公司），兔抗vMIP-Ⅱ一抗（美國R&D 公司），兔抗APOBEC3G 一抗（美國EPIT MICS 公司），辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗、辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠二抗（美國Bio-RAD公司）。cDNA第一鏈合成試劑盒（天根生化科技有限公司）。Lipofectamine?2000 轉染試劑盒（美國Thermo公司）。

大腸桿菌DH5α 及293T 細胞為課題組實驗室保存，293T 細胞用含 10%FBS、100 U/ml 青霉素和100 μg/ml鏈霉素（上海碧云天生物技術有限公司）的DMEM（美國Gibco公司）培養液在37 ℃、5%CO2細胞培養箱中培養。

二、方法

1.vMIP-Ⅱ對 293T 細胞 APOBEC3G 表達的影響：按Lipofectamine?2000 說明書操作，分別轉染空質粒pEGFP-N3（以下簡稱空質粒）和重組質粒pEGFP-N3-K4（以下簡稱轉染vMIP-Ⅱ質粒）至293T 細胞，轉染前3 ～4 h 換為無血清無雙抗的DMEM培養基，轉染4 ～6 h后換成有血清新鮮培養基繼續培養36 h，倒置熒光顯微鏡觀察細胞綠色熒光蛋白的表達，確定重組質粒轉染成功并達到了下游實驗的要求后（圖1），提取兩組細胞總蛋白及總RNA，采用 Western 印跡法檢測 vMIP-Ⅱ 和APOBEC3G 蛋白水平；qPCR 檢 測 APOBEC3G mRNA水平。

2.vMIP-Ⅱ和IFN-α 對 APOBEC3G 表達的影響：用125、250、500、1 000 IU/ml IFN-α處理293T細胞，以加入相同體積0.5%BSA作為對照，36 h后離心收集細胞并抽提細胞總RNA 及總蛋白質，以總RNA 逆轉錄的cDNA 為模板，采用qPCR 進行相對定量（以對照組mRNA相對表達為1），采用Western印跡法檢測APOBEC3G 的蛋白水平。取步驟1 中轉染vMIP-Ⅱ質粒、轉染空質粒的293T 細胞，分為空質粒組、vMIP-Ⅱ質粒組、空質粒 + IFN-α（1 000 IU/ml）組、vMIP-Ⅱ質粒 +IFN-α（1 000 IU/ml）組，培養36 h 后，按Western 印跡法檢測各組細胞APOBEC3G蛋白水平，以空質粒組作為對照組進行數據分析。

3.AG490和U0126對APOBEC3G表達的影響：取步驟1 中轉染vMIP-Ⅱ質粒、轉染空質粒的293T細胞，用不同濃度的JAK/STAT 信號通路的抑制劑AG490（5、20、50、75、100 μmol/L）和不同濃度的ERK信號通路抑制劑U0126（2.5、5、10、20、40 μmol/L）分別處理，以添加相同體積0.5%BSA為對照組，24 h后收集細胞并提取總RNA，qPCR 檢測APOBEC3G mRNA水平。以空質粒組APOBEC3G表達量為“1”，計算各組細胞mRNA水平相對表達水平。

對轉染vMIP-Ⅱ質粒的293T 細胞，分別用75 μmol/L AG490和20 μmol/L U0126處理，以vMIP-Ⅱ質粒組為對照，24 h后收集細胞總蛋白，Western印跡法檢測各組APOBEC3G蛋白水平。

4.Western印跡實驗：磷酸鹽緩沖液（PBS）漂洗細胞 2 次，吸凈 PBS 后，每孔加入含 100 μg/ml 苯甲基磺酰氟的 RIPA 裂解液150 μl，冰上靜置30 min，收集至 1.5 ml 的EP 管中，于 4 ℃、12 000 r/min 離心20 min（離心半徑為4 cm），吸取上清液，BCA 法測定蛋白濃度。配平蛋白濃度，取30 ～80 μg總蛋白上樣，經十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳后，轉移至聚偏二氟乙烯膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h。加入一抗，4 ℃孵育過夜，加入辣根過氧化酶標記的二抗，室溫孵育1 h。電化學發光法發光，曝光，掃描。應用ImageJ軟件對檢測結果圖進行灰度值分析。

5.mRNA 提取、RT-PCR 和實時熒光定量PCR檢測mRNA 的表達：293T 細胞經處理后提取總RNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，應用逆轉錄試劑盒合成cDNA第1鏈，采用特異性引物［生工生物工程（上海）有限公司］進行實時熒光定量PCR 檢測 APOBEC3G 和 vMIP-Ⅱ mRNA 表 達，APOBEC3G正向引物5′-CACGTGAGCCTGTGCATC TTC-3′，反向引物5′-TTGGCTGTGCTCATCTAGTCC ATC-3′；GAPDH 正向引物5′-GCACCGTCAAGGCT GAGAAC-3′，反向引物 5′-ATGGTGGTGAAGACGC CAGT-3′。以 GAPDH 為內參基因，2-ΔΔCt法計算mRNA的相對表達量。

6.APOBEC3G 基因上游轉錄調控區域的生物信息學分析：用SignalScan 對APOBEC3 基因上游2 000 bp（-2000/-1）進行預測對比（http：//thr.cit.nih.gov/cgi-bin/molbio/signal），發現 APOBEC3G 的轉錄因子和順式反應元件主要位于其翻譯起始位點上游1 560 bp 至 240 bp 之間（-1560/-240）。用在線啟動子軟件對APOBEC3G 基因上游2 000 bp的區域進行啟動子位置預測。在http：//snpper.chip.org/mapper/mapper-top 網站，同時選取TRANSFAC matrices、TRANSFAC factors 和 JASPAR matrices 模式以及 http：//www.flruitfly.org/seg_tools/promoter.html多個啟動子相關網站分析APOBEC3G翻譯起始點上游2 000 bp 范圍內可能的轉錄調控區序列（轉錄因子結合位點的順式作用元件）。

7.雙熒光素酶報告基因系統檢測APOBEC3G啟動子上受vMIP-Ⅱ調控的主要作用區域：PCR 擴增APOBEC3G 啟動子序列，分別將起始密碼上游的 240、330、360、420、480、720、960、1 560 bp 大小片段克隆到螢火蟲熒光素酶報告基因（pGL-3）載體上游，構建APOBEC3G 啟動子熒光素酶報告基因質粒，基因克隆實驗送至上海捷瑞生物工程有限公司完成。以表達海腎熒光素酶的質粒為內參質粒。先將2.5 μg vMIP-Ⅱ質粒、熒光素酶報告基因質粒（PGL3-APOBEC3G片段）以及2.5 ng海腎熒光素酶質粒共轉染入293T細胞中，24 ～48 h后，在熒光顯微鏡下觀察同一視野下的細胞數與顯示熒光的細胞數，轉染效率（熒光細胞比例）大于30%時進行下一步實驗。

由于重組螢火蟲熒光素酶的表達載體上有APOBEC3G啟動子調節序列，因此轉染后的熒光素酶活性反映啟動子的活性。構建APOBEC3G 啟動子熒光素酶報告基因重組質粒，APOBEC3G啟動子序列包括APOBEC3G 的全長啟動子序列（POS）與長度 1 560、960、720、480、420、360、330、240 bp 片段及APOBEC3G啟動子序列中不含調控元件的區域（NEG），將熒光素酶報告基因重組質粒與vMIP-Ⅱ質粒共轉染的293T 細胞為實驗組，以與空質粒共轉染293T 細胞為對照，同時轉染海腎熒光素酶質粒為內參，通過比較兩組細胞螢火蟲熒光素酶與海腎熒光素酶的活性比值判斷細胞內APOBEC3G啟動子的活性。熒光素酶活性檢測按照美國Promega公司雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書操作。

三、統計學方法

采用SPSS 13.0軟件，配對資料的比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、vMIP-Ⅱ對APOBEC3G表達的影響

Western印跡法顯示，vMIP-Ⅱ質粒組出現與預期蛋白大小一致的條帶，而空質粒組未出現蛋白條帶（圖2A），重組質粒轉染成功。將空質粒組APOBEC3G mRNA 表達值設為1，結果顯示，vMIP-Ⅱ轉染組相對表達量為2.500±0.013，差異有統計學意義（t=6.22，P＜ 0.01）。Western 印跡法顯示，vMIP-Ⅱ轉染組 APOBEC3G 蛋白水平（1.472 ±0.013）高于空質粒組（0.364 ± 0.030），差異有統計學意義（t=6.54，P＜ 0.05）（圖2B）。

二、vMIP-Ⅱ和IFN-α對APOBEC3G表達的影響

圖2 Western印跡法檢測293T細胞轉染空質粒和病毒巨噬細胞炎癥蛋白Ⅱ（vMIP-Ⅱ）基因質粒的產物2A：vMIP-Ⅱ質粒組出現與預期蛋白大小一致條帶，而空質粒組未出現蛋白條帶；2B：vMIP-Ⅱ質粒轉染組載脂蛋白B mRNA編輯酶催化多肽樣蛋白3G（APOBEC3G）水平高于空質粒組

對照組與125、250、500、1 000 IU/ml IFN-α 組APOBEC3G mRNA 相對表達及蛋白水平差異均有統計學意義（P＜ 0.001），1 000 IU/ml組APOBEC3G mRNA 及蛋白水平均高于對照組（t值分別為6.12、5.57，P＜ 0.001），見表1、圖3。

Western 印跡法顯示，空質粒組、vMIP-Ⅱ質粒組、空質粒 + IFN-α 組、vMIP-Ⅱ質粒 + IFN-α 組APOBEC3G 的蛋白水平（1、2.030 ± 0.108、2.700 ±0.081、2.600 ± 0.099）差異有統計學意義（F=67.026，P＜ 0.001），后3 組均高于空質粒組（t值分別為3.04、4.73、4.82），vMIP-Ⅱ質粒組與空質粒 +IFN-α 組差異無統計學意義（t=3.46，P＞ 0.05），見圖4。

三、AG490和U0126對APOBEC3G表達的影響

0（對照組）、5、20、50、75、100 μmol/L AG490處理的空質粒組、vMIP-Ⅱ質粒組APOBEC3G mRNA水平差異有統計學意義（P＜ 0.001），20、50、75、100 μmol/L AG490 處理的空質粒組均低于對照組（t值分別為 4.67、4.56、5.79、3.84，P＜ 0.05）；空質粒組mRNA 水平均低于相應濃度的vMIP-Ⅱ質粒組（P＜ 0.05）。見表2。0（對照組）、2.5、5、10、20、40 μmol/L U0126 處理的空質粒組、vMIP-Ⅱ質粒組APOBEC3G mRNA 水平差異有統計學意義（P＜0.001），2.5、5、10、20、40 μmol/L U0126 處理的空質粒組均低于對照組（t值分別為 9.18、5.79、5.09、4.92、6.03）；空質粒組mRNA水平均低于vMIP-Ⅱ質粒組（均P＜ 0.01）。見表3。

Western 印跡法顯示，轉染vMIP-Ⅱ質粒的293T細胞，對照組、AG490組、U0126組APOBEC3G蛋白水平分別為 0.617 ± 0.025、0.179 ± 0.061、0.359± 0.012，差異有統計學意義（F=70.019，P＜0.001），AG490組、U0126組水平均低于對照組（t值分別為9.66、11.836，P＜ 0.01），AG490 組水平低于U0126組（t=7.22，P＜ 0.01）。見圖5。

四、vMIP-Ⅱ調控APOBEC3G轉錄活性的關鍵啟動子作用區域

熒光素酶活性檢測結果顯示，轉染了POS、1 560、960、720、480、420、360、330、240、NEG 序列的vMIP-Ⅱ質粒組啟動子活性差異有統計學意義（F=81.092，P＜ 0.001），隨著轉染的克隆片段的截短，APOBEC3G 啟動子活性呈降低趨勢，從720 片段至 480 片段活性降低幅度巨大，480、420、360、330、240、NEG片段的啟動子活性相差不大（圖6）。

表1 不同濃度干擾素α對239T細胞載脂蛋白B mRNA編輯酶催化多肽樣蛋白3G（APOBEC3G）mRNA及蛋白表達的影響（）

表1 不同濃度干擾素α對239T細胞載脂蛋白B mRNA編輯酶催化多肽樣蛋白3G（APOBEC3G）mRNA及蛋白表達的影響（）

注：n=3。qPCR檢測mRNA水平，以對照組APOBEC3G mRNA水平為1，計算各組相對水平；Western印跡法檢測APOBEC3G蛋白水平。a 與對照組比較，P ＜0.001

APOBEC3G mRNA蛋白水平0（對照組）1 0.104±0.098 125 IU/ml 1.508±0.098 0.118±0.046 250 IU/ml 1.897±0.011 0.118±0.046 500 IU/ml 1.755±0.058 0.178±0.006 1 000 IU/ml 2.045±0.007a 0.204±0.035a F值80.541 69.830 P值＜0.001＜0.001

圖3 Western 印跡法檢測不同濃度干擾素α 對239T 細胞載脂蛋白B mRNA 編輯酶催化多肽樣蛋白3G（APOBEC3G）水平的影響1 000 IU/ml干擾素α組APOBEC3G蛋白水平高于對照組 圖4 Western印跡法檢測轉染空質粒、vMIP-Ⅱ質粒及干擾素（IFN）α對293T細胞載脂蛋白B mRNA編輯酶催化多肽樣蛋白3G（APOBEC3G）蛋白水平的影響 vMIP-Ⅱ質粒組、空質粒+IFN-α組水平均高于空質粒組

表2 不同濃度JAK/STAT信號通路抑制劑（AG490）對分別轉染空質粒與vMIP-Ⅱ質粒的293T細胞APOBEC3G mRNA表達的影響（2-ΔΔCt，）

表2 不同濃度JAK/STAT信號通路抑制劑（AG490）對分別轉染空質粒與vMIP-Ⅱ質粒的293T細胞APOBEC3G mRNA表達的影響（2-ΔΔCt，）

注：n=3。vMIP-Ⅱ：病毒巨噬細胞炎癥蛋白Ⅱ；APOBEC3G：載脂蛋白B mRNA編輯酶催化多肽樣蛋白3G。a 與對照組相比，P ＜0.05

組別AG490 F值P值空質粒組vMIP-Ⅱ質粒組t值P值0（對照組）1.00 2.089±0.456 8.23＜0.01 5 μmol/L 1.042±0.063 1.972±0.003 7.90＜0.01 20 μmol/L 0.474±0.045a 1.207±0.033 8.05＜0.05 50 μmol/L 0.516±0.035a 1.148±0.014 9.51＜0.01 75 μmol/L 0.301±0.034a 0.837±0.006 6.52＜0.001 100 μmol/L 0.521±0.004a 0.987±0.085 6.52＜0.001 80.430 68.076＜0.001＜0.001

表3 不同濃度ERK信號通路抑制劑（U0126）對分別轉染空質粒與vMIP-Ⅱ質粒的293T細胞APOBEC3G mRNA表達的影響（2-ΔΔCt，）

表3 不同濃度ERK信號通路抑制劑（U0126）對分別轉染空質粒與vMIP-Ⅱ質粒的293T細胞APOBEC3G mRNA表達的影響（2-ΔΔCt，）

注：n=3。vMIP-Ⅱ：病毒巨噬細胞炎癥蛋白Ⅱ；APOBEC3G：載脂蛋白B mRNA編輯酶催化多肽樣蛋白3G。a 與對照組相比，P ＜0.05

組別空質粒組vMIP-Ⅱ質粒組t值P值0（對照組）1.00 2.062±0.135 6.02＜0.01 2.5 μmol/L 0.963±0.035a 2.306±0.148 4.72＜0.01 U0126 5 μmol/L 0.989±0.078a 1.983±0.026 7.80＜0.01 10 μmol/L 0.954±0.121a 2.009±0.128 7.54＜0.01 20 μmol/L 0.961±0.067a 1.978±0.030 8.28＜0.01 40 μmol/L 0.964±0.047a 1.912±0.028 6.03＜0.01 F值69.031 70.309 P值＜0.001＜0.001

圖5 Western 印跡法檢測轉染病毒巨噬細胞炎癥蛋白Ⅱ（vMIP-Ⅱ）質粒的293T 細胞采用AG490（JAK/STAT 信號通路抑制劑）、U0126（ERK 信號通路抑制劑）處理后載脂蛋白B mRNA 編輯酶催化多肽樣蛋白3G（APOBEC3G）蛋白表達

圖6 雙熒光素酶報告基因系統檢測APOBEC3G 啟動子上vMIP-Ⅱ上調APOBEC3G 表達的主要作用區域 隨著轉染的克隆片段的截短，APOBEC3G啟動子活性呈降低趨勢，從720 bp片段至480 bp 片段活性降低幅度巨大，480、420、360、330、240 bp 及NEG片段的啟動子活性相差不大

討 論

早期流行病學研究發現，并發KS 的艾滋病患者相對于并發其他疾病者存活時間更長［10］，之后，在KSHV 感染的細胞中以及轉染KSHV 某些基因的細胞中均發現一些抗HIV 基因表達上調［11］。Cherqui 等［9］發現，KSHV vMIP-Ⅱ基因使人臍靜脈內皮細胞內CCL5、APOBEC3G、ISG-15 和OAS-1 等多條抗HIV 基因表達明顯上調。以上研究提示，KSHV 的某些基因能以上調宿主抗HIV 基因表達的方式抑制HIV 感染。APOBEC3G 屬于胞嘧啶脫氨酶家族成員，含兩個胞嘧啶脫氨酶結構域，通過誘導HIV-1 基因組發生致死性突變等方式抑制HIV-1 感染［12-13］。本研究證實，vMIP-Ⅱ可以上調APOBEC3G 基因表達，且其上調APOBEC3G 的能力與IFN-α相當。

對 APOBEC3G 轉錄水平調節的研究［14-15］表明，JAK-STAT 通路是調控APOBEC3G 表達信號的主要信號通路，受不同細胞因子的刺激，相應JAK 分子磷酸化發揮激酶活性，活化不同的STAT 分子形成同二聚體或異二聚體結合到啟動子上的干擾素調節因子元件（IFN regulatory factor element，IRF-E）或干擾素反應元件（IFN-stimulated response elements，ISRE）等順式作用元件上，激活基因的轉錄。干擾素主要通過JAK-STAT 信號通路上調APOBEC3G 基因表達，而 vMIP-Ⅱ是 KSHV 基因表達的外分泌蛋白，需要與特殊的受體結合才能發揮作用。本研究也發現，vMIP-Ⅱ上調APOBEC3G 的能力與IFN-α 相當。我們使用AG490 阻斷JAK/STAT 信號通 路 、U0126 阻 斷 ERK 信 號 通路后，vMIP-Ⅱ誘導細胞內APOBEC3G表達的功能均受到抑制，AG490 組 APOBEC3G 表達量低于 U0126 組，提示在vMIP-Ⅱ調控細胞內APOBEC3G 表達的機制中JAK/STAT信號通路發揮了主要作用。

我們進一步從轉錄水平上研究了vMIP-Ⅱ誘導細胞內APOBEC3G 表達的機制，通過轉染不同長度的APOBEC3G 啟動子序列與vMIP-Ⅱ質粒至293T細胞中，發現APOBEC3G啟動子活性從720片段至480 片段降低幅度巨大，提示vMIP-Ⅱ上調APOBEC3G 表達的關鍵啟動子區域在翻譯起始點上游 720 bp 到 480 bp 之間，且 720 bp 到 480 bp 間的調控元件為MZF-1、E47 和MZF1，而已有文獻［16］提示，STAT 可上調E47 的表達而啟動下游基因的轉錄。因此，我們推測vMIP-Ⅱ激活APOBEC3G 表達可能機制為，vMIP-Ⅱ與趨化因子受體結合，使細胞內的JAK 分子磷酸化，JAK 發揮激酶活性活化STAT 分子并形成二聚體，轉位到細胞核內，結合到APOBEC3G 啟動子的E47 調控元件區，啟動APOBEC3G 表達，但JAK/STAT 信號通路調控APOBEC3G 啟動子活性的具體機制尚需要進一步研究。

總之，vMIP-Ⅱ除了在細胞外與HIV-1 輔助受體CCR5 等結合封閉受體從而抑制HIV-1 進入宿主細胞外，還可能通過結合某些受體，活化JAKSTAT 信號通路，上調APOBEC3G 表達，發揮抑制HIV-1 感染的功能。該假說可以解釋vMIP-Ⅱ上調APOBEC3G 表達的現象及其在表達不同受體細胞中抗HIV-1功能的差異。因此，在激活宿主免疫基因抑制HIV 感染方面，vMIP-Ⅱ具有不可忽略的優勢。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突