淺部真菌病熒光染色顯微成像及計算機輔助診斷系統的初步臨床應用

田靚 劉越 毛葉紅 連昕 李寧 呂曉華 陶娟 曾紹群 冉藝 曾敬思

1華中科技大學-武漢光電國家研究中心 Britton Chance 生物醫學光子學研究中心，武漢 430074；2華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院皮膚性病科，武漢 430022

田靚現在武漢大學中南醫院設備處 430071

劉越現在華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院醫學工程科 430022

淺部真菌病是一大類常見的真菌感染性疾病，其菌學診斷目前仍依賴于致病真菌的鏡檢和培養鑒定。盡管熒光染色液的應用提高了鏡檢的準確性和效率［1-3］，特別是一步法熒光染色液的應用使檢驗變得更加便捷［4-5］。但仍需專業技術人員對結果進行判讀，如果面臨大量樣本待檢，檢驗人員將承受巨大的勞動強度。目前顯微成像系統（圖像自動掃描）不僅限于生物基礎研究領域，如腦神經成像［6］，而且已開始應用于臨床組織病理切片圖像的采集［7］，這為采用人工智能對影像數據做出結果判別提供了可能。國外已有學者［8］研發出圖像處理系統，用于自動識別淺表真菌病臨床標本熒光顯微圖像中的真菌菌絲，取得滿意效果，但尚未用于臨床檢驗。本研究采用自主研發的熒光染色顯微成像及計算機輔助診斷系統（automated fluorescence microscopic imaging and computer aided diagnosis system，AFMICADS）檢測臨床疑似淺部真菌病送檢真菌標本，以觀察該系統在臨床真菌學檢驗中應用的效果。

一、材料和方法

1.標本及來源：據2016年華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院皮膚性病科真菌室分離、鑒定的病原真菌統計分析，致病菌最多分離自體股癬患者，其次為甲真菌病和手足癬患者（數據未發表）。故將來自上述疾患部位的皮屑、甲屑作為研究標本。2018年7-9 月華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院各臨床科室門診及住院疑似淺部真菌感染患者 106 例，男 50 例，女56 例，年齡6 ～ 72 歲。本研究獲得華中科技大學同濟醫學院醫學倫理委員會批準（［2017］倫審字S008號），并免除知情同意。

2.主要試劑和儀器：一步法真菌熒光染色液Ⅱ型（南京漢瑞生物科技有限公司）；Leica DM500熒光顯微鏡（瑞士萊卡生物系統貿易有限公司）；熒光染色顯微成像及計算機輔助診斷系統（AFMICADS）為華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院皮膚性病科與武漢光電國家研究中心合作研發（專利申請號CN201810863813.1），計算機配置GeForce GTX1080顯卡，Excel 2007分析軟件。

3.方法：每例患者每個檢查部位取1個標本，送檢標本126 份，其中皮膚鱗屑83 份，甲屑43 份。將每一標本分成3 份，分別用于常規鏡檢（10%氫氧化鉀溶液制片）、改良沙氏培養基培養（25 ℃）及熒光染色鏡檢。熒光染色鏡檢包括熒光染色人工鏡檢（下簡稱“人工熒光鏡檢”）及AFMICADS熒光鏡檢。鏡檢發現菌絲和/或孢子（包括芽孢）均認為鏡檢結果為陽性。培養分離所得菌株進行常規的形態學觀察（菌落及鏡下形態）、生理和生化實驗方法鑒定菌種。其中酵母及酵母樣菌的菌種鑒定使用API20 C AUX酵母菌鑒定系統。

熒光染色鏡檢方法：將1 滴熒光染液（約50 μl）滴加到放置于載玻片上的標本處，加蓋蓋玻片后，輕壓至標本薄如云霧狀，吸去蓋玻片周圍溢出的多余染液。先人工熒光鏡檢，后用AFMICADS 熒光鏡檢。AFMICADS 熒光鏡檢的簡要流程為：將玻片上標本中心置于掃描鏡頭下（×200 倍），1 次掃描（25 個視野，0.202 mm2/視野）后進行分析，分別提取并顯示概率值（可疑區域疑似為陽性的平均概率值）最高的5 個真菌成分截圖，經人工確認后，若為陽性結果，即給出檢驗報告。否則逐個增加掃描次數，獲得陽性結果即止，最多增加4 個掃描。增加的掃描點位于初次掃描點的左上、左下、右上、右下，掃描范圍與初次掃描點相鄰，不重疊。同樣提取增加的每個掃描點中概率值最高的5個真菌成分截圖，一旦經人工確認陽性后，即給出檢驗報告。完成5次掃描后，經人工確認均未見真菌成分時，結果判斷為陰性，給出檢驗報告。分別記錄常規鏡檢及兩種熒光染色鏡檢方法檢驗一個標本所需時間。

標本取材、10%KOH和熒光染色制片、常規鏡檢、培養鑒定由1 名經驗豐富的檢驗員單獨完成，熒光人工鏡檢和AFMICADS 熒光鏡檢由另一接受過專業培訓的人員獨立完成。

4.數據統計分析：皮膚癬菌病（體股癬、手足癬和甲癬等）菌學診斷的陽性標準是常規鏡檢和/或真菌培養陽性（培養得到的菌落鑒定為皮膚癬菌時為陽性結果，僅滿足任意1 項即可為陽性）。對于由念珠菌感染引起的皮膚黏膜念珠菌病、非皮膚癬菌性霉菌等感染引起的淺表皮膚感染（包括非甲癬的甲真菌病、手足部感染等），菌學診斷的陽性標準是常規鏡檢和培養均陽性，且鏡檢所見真菌菌絲、孢子形態特征與分離培養所得菌株相符合。計算2種熒光鏡檢和陽性標準方法（常規鏡檢和/或真菌培養）檢測所有標本的陽性率。以常規鏡檢和/或真菌培養陽性為標準，計算2種熒光鏡檢方法的一致性、敏感性、特異性、陽性預測值和陰性預測值。采用配對四格表χ2檢驗（McNemar 檢驗）和Kappa檢驗，分析2種熒光鏡檢方法檢測陽性率與常規鏡檢和/或真菌培養結果間有無差異。Kappa 檢驗所得Kappa值 ≥ 0.75 為高度一致，0.4 ～ ＜ 0.75 為中度一致，＜ 0.4 為一致性差；檢驗水準α = 0.05。使用診斷符合率檢驗［9］分析2種熒光鏡檢方法之間一致性有無差異，檢驗水準α=0.05。

二、結果

各種鏡檢及培養法檢測皮屑與甲屑標本陽性率的差異均無統計學意義，見表1。126份標本中，真菌培養陽性59份（46.8%），菌種分別為：紅色毛癬菌45 份、犬小孢子菌2 份、指（趾）間毛癬菌2 份、白念珠菌6 份、念珠菌3 份及紅色毛癬菌與念珠菌混合感染1 份。人工熒光鏡檢陽性124 份（98.4%），AFMICDADS 熒光鏡檢陽性123 份（97.6%），常規鏡檢陽性95份（75.4%）。人工熒光鏡檢與AFMICADS熒光鏡檢陽性率均顯著高于常規鏡檢和/或真菌培養［陽性98例（77.8%），均P＜ 0.01），Kappa 值分別為0.107 和0.157（均P＜ 0.001）。見表2。

與常規鏡檢和/或真菌培養結果相比，人工熒光鏡檢的敏感性和特異性分別為100.0%和7.1%，一致性為79.4%，陽性預測值79.0%，陰性預測值100.0%；AFMICADS 熒光鏡檢的敏感性和特異性分別為100.0%和10.7%，一致性為80.2%，陽性預測值79.7%，陰性預測值100.0%（表2）。AFMICADS熒光鏡檢與人工熒光鏡檢的一致性差異無統計學意義（診斷符合率檢驗u=0.125，P＞ 0.05）。

常規鏡檢和人工熒光鏡檢觀察到真菌成分的時間約為1 ～2 min，200 倍鏡下掃描全片確認無真菌的時間約為8 ～10 min。AFMICADS 完成1 次掃描需2 min，識別并輸出陽性結果的時間為3 ～5 min，識別并輸出陰性結果的時間為1 ～1.5 min。這樣AFMICADS 完成鏡檢的時間范圍最短5 min（1 次掃描，陽性結果），最長21 min（5 次掃描，陽性結果）。

三、討論

盡管顯微成像系統結合計算機輔助識別技術已用于一些常見腫瘤組織病理診斷，但尚未見將計算機輔助識別技術用于淺部真菌病臨床檢驗的報道。M?der 等［8］使用與本研究中AFMICADS 不同的算法，即分析真菌的形態特征及直方圖特征，根據統計信息判斷是否有陽性感染，對淺部真菌病的臨床標本圖像識別的敏感性和特異性分別達到了83%和79%，但尚未見該研究成果的轉化及在臨床上實際應用效果的報道。本研究中AFMICADS系統采用深度語義分割算法，雖未分別識別真菌菌絲和孢子或研究分析各自的敏感性，但與M?der 等［8］使用的算法相比，AFMICADS 系統具有分割準確、不易遺漏及敏感性更高等特點。

本研究結果顯示，AFMICADS 熒光鏡檢與人工熒光鏡檢的一致性相當。兩者均呈現出敏感性高，特異性低的特點。以常規鏡檢和/或真菌培養結果為參照，特異性反映的是受試方法判斷出真陰性的比例。兩種熒光鏡檢陽性率均高于常規鏡檢和/或真菌培養結果，30份按陽性標準判斷為陰性的標本中分別有25 份和26 份被AFMICADS 熒光鏡檢與人工熒光鏡檢判斷為陽性，從而使兩種熒光鏡檢的真陰性標本數大幅減少，特異性明顯下降。因此，參照目前的標準得出熒光鏡檢的特異性未能客觀反映熒光鏡檢的真實特性。另外，本研究中4 種檢測方法檢測均為陰性的標本數量少（僅1份），也在一定程度上影響了特異性的精確評估。

表1 3種鏡檢及培養法檢測疑似淺部真菌感染患者的皮屑及甲屑標本中的真菌陽性率比較［陽性數（%）］

表2 疑似淺部真菌感染患者標本3種鏡檢法真菌檢測結果比較

AFMICADS熒光鏡檢與人工熒光鏡檢均有著較高的陽性預測值和陰性預測值。雖然兩種熒光鏡檢的特異性均低，但陽性預測值也接近80%，這與淺表皮膚真菌病患病率高，以及到醫院就醫患者中淺表皮膚真菌病患者比例較高有關。盡管淺表皮膚真菌病患病率高，但兩種熒光鏡檢的陰性預測值均高，這與兩者的敏感性高相關。此結果表明，熒光鏡檢具有良好的協助臨床診斷價值。

已有研究顯示，人工熒光鏡檢明顯優于常規鏡檢［1-3］，其在國內外真菌臨床檢驗中也已被廣泛應用多年。對于臨床淺部真菌感染標本，AFMICADS 熒光鏡檢是取代人工熒光鏡檢的可靠方法之一，具有良好的臨床應用前景。目前國內外尚未見與AFMICADS類似的商業化診斷系統。

AFMICADS熒光鏡檢時，無論掃描標本中菌量多少，均不易被遺漏，還能節省人工檢驗時間，降低檢驗員的勞動強度。對于細小的、肉眼不易發現的孢子或菌絲也不易被AFMICADS 熒光鏡檢漏檢，常規鏡檢易將植物纖維和衣物纖維誤判為菌絲的情況在AFMICADS 熒光鏡檢時很少出現，這是該系統的優勢。計算機診斷對熒光染色弱的真菌成分識別能力低，易將強熒光著色的背景物質及氣泡邊緣誤判為真菌成分，且在離焦區域誤判概率較高，以至于單純依靠計算機診斷時幾乎沒有陰性結果，即特異性差。目前，在腫瘤組織病理診斷中計算機識別僅作為輔助手段。因此，本試驗所用系統暫采用計算機輔助人工診斷的方法（即人機協同診斷）來提高診斷的特異性。此外，我們將通過標準化地制備樣本以減少樣本中的氣泡，并加大訓練樣本量和/或改進調焦算法提高采集圖像的質量，以減少誤判。

AFMICADS 熒光鏡檢與人工熒光鏡檢相比，速度上尚無明顯優勢。但當面臨大量標本，特別是進行流行病學調查或疾病篩查時，人工取材和AFMICADS 熒光鏡檢能同時進行，就會顯示出其省時、高效批量處理的優勢。當然，對標本進行預處理再制片使涂片厚度趨向均一，改進機器識別策略和算法，提高計算機性能等，均可進一步減少耗時。此外，利用本系統中的熒光顯微成像系統便于大量采集、記錄臨床標本中真菌形態的影像數據，為將來進行大數據分析，探索機器識別鏡檢圖像即對常見致病真菌做出快速菌種鑒定創造條件。

本研究中淺部真菌感染標本經熒光染色后，無論是人工熒光鏡檢還是AFMICADS熒光鏡檢陽性率均顯著高于常規鏡檢和/或真菌培養結果。本研究中所使用的真菌熒光染液主要成分為與真菌細胞壁中β-多糖非特異性結合的鈣熒光白。盡管有文獻［3-4］報道，特異性熒光染液（如熒光素標記的重組幾丁質酶染液）用于淺部真菌病真菌鏡檢時，檢出陽性率顯著高于常規鏡檢和鈣熒光白染色鏡檢，但鈣熒光白染色法的檢出陽性率與常規鏡檢差異無統計學意義［1-4］。這與本研究結果不一致，不排除受試臨床標本種類不同、檢驗人員技術水平不齊、所用鈣熒光白試劑來自不同廠家等因素造成的差異。與常規鏡檢相比，由于熒光染色使真菌成分易于辨認，熒光染色鏡檢時在全片中僅見到數個出芽或未出芽孢子的情況較多見，但其是否有臨床意義尚待觀察研究。

鑒于本研究為將機器視覺用于淺部真菌病致病菌臨床鏡檢的初步嘗試，故還存在一些不足，如標本量較少。展望未來研究工作，尚需解決標本涂片厚度均一化的問題，進一步增加訓練樣本量，改進調焦算法，提高采集圖像的質量等，以縮短檢驗時間，提高特異性，最終實現全自動真菌鏡檢，并用更大量的標本進行臨床應用檢驗。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突