耐鎘功能內生菌的篩選及其固定化處理含鎘廢水

楊 培， 石先陽

(安徽大學 資源與環境工程學院，合肥 230601)

鎘(cadmium，Cd)可從細胞、組織、器官等層面對生物體產生毒害作用[1-4]。含鎘廢水處理方法如沉淀法、蒸發法、氧化法、萃取法等在處理低濃度含鎘廢水時存在費用高、易產生二次污染等缺點[5-7]。生物處理法因能有效避免類似問題而備受關注[8]。

近年來，國內外學者開展了固定化微生物技術處理含鎘廢水的研究。例如在Cd2+濃度為120 mg/L的條件下，利用海藻酸鈉固定化酵母菌處理含鎘廢水，去除率為80.45%，較游離態酵母菌吸附Cd2+提高了12.5%[9]。以改性的Fe3O4結合海藻酸鈉對Bacillusnealsonii固定化，對Cd2+的去除率達96%，并可循環使用[10]。固定化啤酒廢酵母在不同吸附時間、pH、Cd2+初始濃度等因素下對Cd2+的去除率為79.82%，且微生物流失少，對環境無二次污染[11]。然而，能高效吸附廢水中Cd2+的微生物及其固定化生物吸附劑鮮有報道[12]。植物內生菌為一類對植物生長無害的細菌、真菌或放線菌[13]，對重金屬具有較強的耐受性，目前主要是將其與各種植物聯合修復受重金屬污染的水體、土壤等，是一類在吸附重金屬方面很有應用潛力的微生物[10]。

本文通過從蘆葦根際組織中分離植物內生細菌ChryseobacteriumrhizosphaeraeSH-1，探究其對Cd2+的耐受性；經海藻酸鈉固定化制成生物吸附劑，研究pH、溶液起始金屬離子濃度等因素對鎘吸附的影響，并采用動力學方法對結果進行分析，以期為含鎘廢水的處理提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 菌株分離與鑒定

內生細菌的培養采用LB固體培養基，其成分為蛋白胨 10.0 g，酵母粉 5.0 g，NaCl 10.0 g，瓊脂粉 16.0 g，pH 7.0，去離子水補至1000 mL，1×105Pa，滅菌20 min。Cd2+儲備液的配置：5 g CdCl2溶解到50 mL去離子水中，0.22 μm濾膜過濾滅菌，-20 ℃保存。實驗用水均由Milli-Q提供，所需Cd2+濃度從該儲備液稀釋。

內生菌的分離：清洗蘆葦根部，75%(體積比)的無水乙醇浸泡1 min后轉至5%的次氯酸鈉中消毒，用無菌水沖洗。取100 μL無菌水涂布于LB平板中培養48 h，若無細菌生長則消毒成功，否則重新消毒。無菌條件下研磨蘆葦根部，將研磨液逐級進行10倍系列(10-1～10-8)稀釋，取100 μL研磨液涂布，30 ℃培養1～2 d后挑取單菌落，多次劃線，將菌液與40%(體積比)的甘油以體積比1∶1的比例混合后于-20 ℃條件下保存。

為提取菌株的DNA，以16S rRNA基因通用合成引物27F (5′-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)進行PCR擴增[14]。PCR反應體系(15 μL)為：ddH2O 9.95 μL，10×Buffer 1.5 μL，dNTP 1.2 μL，27F 0.6 μL，1492R 0.6 μL，TaqDNA聚合酶 0.15 μL和模板 DNA 1 μL。PCR擴增程序: 94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s，20個循環；72 ℃延伸1 min，72 ℃終延伸10 min,4 ℃保存。由上海生工生物有限公司完成測序，結果提交GenBank，進行BLAST比對分析[15]。

1.2 Cd2+對菌株的最小抑菌濃度(MIC)測定

將不同濃度的Cd2+加入LB中并混勻，倒平板。以不添加任何重金屬的LB平板作為對照，挑取處于對數生長期的菌株于不同Cd2+濃度的培養基中劃線，30 ℃培養3 d，若培養基中無單菌落出現，則可判定該濃度為最小抑菌濃度。

1.3 菌株的形態學分析

采用S-4800場發射掃描電子顯微鏡(Hitachi，日本)在工作電壓3 kV 下觀察菌株吸附Cd2+前后的微觀結構，其中將未吸附Cd2+的菌株作為對照組；使用VERTEX 80/80v FTIR 型傅立葉紅外光譜儀在 4000～400 cm-1內掃描菌株吸附Cd2+前后變化。

1.4 內生菌固定化

將菌株接種到LB固體培養基中，30 ℃培養48 h，3次分離純化，挑取單菌落接種于液體LB中，30 ℃，150 r/min培養48 h后 10 000 r/min，10 min，棄上清，用無菌水洗滌，離心得濕菌體，將其以5%體積比與4%的海藻酸鈉混勻。將混合液倒入20 mL的注射器內，勻速滴入0.3 mol/L CaCl2溶液中，注射器頭與液面的距離保持在20 cm左右，至形成4 mm的固定化凝膠小球，攪拌1 h，用無菌水沖洗凝膠小球表面3次，于4 ℃保存作為實驗組備用。不添加菌體，按上述同樣方法制備空白小球作為對照組。

1.5 Cd2+吸附實驗設計

探究時間、pH值、Cd2+初始濃度對固定化微生物吸附Cd2+的影響。分別加入固定化SH-1小球(實驗組)和海藻酸鈉小球(對照組，干重0.022 g)于相同規格的錐形瓶中，在30 ℃，200 r/min條件下于不同時間間隔(15、30、60、120、240、360、480和600 min)取樣；相同條件下用1 mol/L HCI和1 mol/L NaOH調節溶液pH為2、3、4、5、6和7，于480 min時取樣；其他因素不變，Cd2+初始濃度調為100、200、300、400、500和600 mg/L，pH 5，于480 min時取樣。上清液經0.22 μm的濾膜過濾，使用ICP (iCAP 7400 Duo) 測定Cd2+濃度。每組實驗設置3組平行，結果取其平均值。

1.5.1 Cd2+吸附模型

以單位小球吸附率和吸附量表征Cd2+的吸附效率，計算公式如下[16]：

(1)

(2)

式中：a為單位小球吸附率；C0為重金屬離子起始濃度(mg/L)；qe為單位小球吸附量(mg/g)；Ce為吸附平衡后重金屬離子濃度(mg/L)；Vt為溶液的總體積(L)；M為吸附劑的干重(g)。采用準一級吸附動力學(式3)和準二級吸附動力學模型(式4)描述固體吸附劑與液相吸附質的動力學關系[17]。

式中：qe為平衡吸附量(mg/g)；qt為t時刻吸附量(mg/g)；k1為準一級動力學速率常數；k2為準二級動力學速率常數。通過Langmuir(式5)和Freundlich模型(式6)來擬合固定化微生物的物理吸附和化學吸附過程[18]。

(3)

(4)

(5)

(6)

式中：qmax為單分子層飽和時的吸附容量(mg/g)；KL為Langmuir常數；qe為平衡吸附量(mg/g)；KF為異相吸附劑的Freundlich常數；Ce為金屬離子初始濃度(mg/L)；n為與吸附位能量分布相關的Freundlich常數。

1.5.2 固定化小球解吸附實驗

為了探究固定化小球的重復利用率，本實驗用0.1 mol/L HCl對小球進行解吸附研究。將吸附后的小球用ddH2O沖洗后，250 r/min解吸2 h，通過0.22 μm的濾膜過濾取上清，用ICP測溶液中的Cd2+濃度，并計算解吸率。每次實驗的小球用ddH2O重懸于4 ℃保存，待下次使用。

(7)

式中:mdes為解吸附Cd2+的量(mg/g)；mads為吸附Cd2+的量(mg/g)。

1.6 實際廢水應用

從校園內某教學樓一樓廢水排放口采集一定量廢水，按照2.5中探討的固定化菌株吸附Cd2+的最佳條件，在30 ℃，200 r/min條件下培養，隨時間測定廢水中剩余Cd2+濃度。

2 結果與討論

2.1 菌株的鑒定

將菌株的16S rRNA序列與數據庫中的序列進行BLAST比對，由菌株的系統發育樹(圖1)分析可知菌株與ChryseobacteriumrhizosphaeraeRSB3-1T的同源性為99.3%，將得到的基因序列提交到GenBank，得登錄號為MH014969, 長度為1480 bp的基因序列，因此確定該菌株為根際金黃桿菌屬，命名為SH-1。

圖1 SH-1 系統發育樹分析

2.2 Cd2+對菌株的MIC測定

如表1所示，菌株SH-1對Cd2+表現出很強的抗性。對該菌株在不同濃度重金屬離子的固體培養基中生長情況可知，其最小抑菌濃度(MIC)值為450 mg/L，表明菌株對重金屬Cd的高抗性預示著它在實際應用中有很大的潛力。

2.3 菌株吸附Cd2+的形態學分析

菌株SH-1(圖2-a)為桿狀，無莢膜，且表面光滑飽滿。添加100 mg/L的Cd2+(圖2-b)后，菌株表面附有白色顆粒，與李學龍等[19]研究結果相比，進而推測出細胞表面可能有特定的結構吸附金屬，且在Cd2+脅迫下，菌株SH-1通過產生該結構去除Cd2+帶來的不利影響。

表1 菌株SH-1最小抑菌濃度測定結果

注： “+++”良好抗性；“++”較好抗性；“+-”有抗性，但生長不好，“-”無抗性

a: 對照組(標尺1 μm)；b: 100 mg/L Cd2+(標尺 1 μm)

圖2SH-1吸附Cd2+前后掃描電鏡圖

Figure 2 SEM of SH-1

圖3 SH-1吸附Cd2+ FTIR光譜分析

傅里葉紅外(FTIR)分析(圖3)顯示菌株SH-1未吸附Cd2+前(a曲線)在3290 cm-1處具有強而寬的特征吸收峰，為典型的羥基吸收帶，這是由O-H的伸縮振動和N-H的伸縮振動發生耦合作用而增寬的吸收峰；2923 cm-1處的吸收峰是由C-H的伸縮振動造成的；2131 cm-1處有N≡C-吸收峰；1645 cm-1處出現尖而短的蛋白質酰胺I帶吸收峰；1548 cm-1處吸收峰是由-NO2的振動引起的；1242 cm-1處的吸收峰主要由C=S 和 P=O 鍵的伸縮振動引起的；1082 cm-1處的吸收峰是S-O反對稱伸縮振動形成的吸收峰；菌株SH-1吸附Cd2+后的光譜圖較吸附前峰形基本保持不變。3290、2923、2131、1645、1548、1242、1082 cm-1處的吸收峰分別移動到3296、2925、2119、1656、1546、1240、1080 cm-1處，菌株吸附Cd2+后(b曲線)3290、2923、1645 cm-1處的吸收強度增加，劉楊眉等[20]認為這可能是在吸附Cd2+后，菌株本身的結構未破壞，也無新的物質生成，而O-H、N-H、C-H、N≡C-、-NO2、C=S、P=O、S-O等基團可能參與了吸附作用。

2.4 不同因素對固定化SH-1吸附Cd2+的影響

由圖4可知，實驗組在前30 min吸附Cd2+速度快，30 min后速度變緩，480 min后達到平衡，此時吸附量為50.6385 mg/g，而對照組吸附量僅為46.9303 mg/g。

圖4 吸附時間對固定化微生物吸附的影響

由圖5所示，當溶液pH值由2增加到5時，實驗組對Cd2+的吸附量和去除率逐漸增加，pH值由5增加到7時，吸附量和去除率則逐漸降低。由此可知，最適pH值為5。當pH值為5時，其對Cd2+的吸附量為55.238 mg/g，去除率為93.24%；對照組小球則分別為49.327 mg/g和85.14%，據文曉鳳等[10]的研究可知，這可能是由于固定化微生物小球表面、孔隙均可供內生菌SH-1附著，且SH-1細胞表面的羥基能螯合轉化吸附Cd2+，并對Cd2+有著一定的吸附、轉化作用。

由圖6可知，當Cd2+初始濃度為100 mg/L時，固定化SH-1小球對Cd2+的吸附量和去除率分別為51.485 mg/g、87.56%，而對照組小球則分別為43.667 mg/g、74.264%。當Cd2+初始濃度大于100 mg/L，SH-1小球對Cd2+的去除率逐漸下降。這與陳亞奎[21]的研究結果相一致，即隨著Cd2+的濃度增加，固定化小球表面的吸附官能團與Cd2+的結合量增大，從而對其去除率降低。

綜上，當反應時間為480 min，pH值為5，起始濃度為100 mg/L時，固定化SH-1小球對Cd2+的吸附率最佳，效率達93.24%，高于相關的文獻報道[22]。以上結果通過t檢驗法證明且得出P<0.05，進而說明實驗組小球相比對照組小球對Cd2+的吸附效率有顯著提高。

圖5 pH值對固定化微生物吸附的影響

圖6 Cd2+初始濃度對固定化微生物吸附的影響

2.5 固定化SH-1吸附模型

采用Langmuir和Freundlich吸附模型對Cd2+的吸附過程進行線性擬合，結果如圖7-a、 b，擬合的相關參數計算見表1。固定化SH-1小球的Langmuir相關系數比Freundlich方程要高，超過了0.99。因此，Langmuir方程能更好地擬合其吸附Cd2+的過程，表明其吸附過程主要為單分子吸附。

表2 固定化微生物吸附Cd2+等溫參數

動力學模型分別如圖7-c、 d，相關參數見表2。由表2可知，其準二級動力學系數高于準一級動力學。說明準二級動力學能更好地描述Cd2+的吸附過程，也就是化學鍵的形成對吸附起著重要的作用。從表2和表3看出，實驗組小球的最大吸附量比對照組小球的高；進而說明實驗組小球吸附Cd2+的能力要高于對照組小球。

圖7 固定化SH-1小球吸附Cd2+等溫模型和動力學模型

2.6 固定化小球解吸附實驗

此外，圖8表明在3次循環之后，對照組和實驗組對Cd2+的平均解吸附率分別為88.45%和95.15%；進一步說明固定化SH-1小球可高效反復地吸附水溶液中的Cd2+，能有效地循環利用；且實驗組小球的解吸附能力要遠高于對照組小球，實驗結果與文曉鳳等[10]結果一致。

2.7 實際廢水應用

圖9描述了固定化小球對廢水中Cd2+的吸附情況。結果表明，在反應時間為480 min時，對照組和實驗組對Cd2+的去除率分別為75.41%和85.95%，說固定化小球能有效去除實際廢水中Cd2+，但去除率和吸附量均低于實驗數值，這可能是由于實際廢水中成分復雜，含有其他物質競爭吸附，進而影響吸附結果，該結果表明固定化SH-1小球在去除實際工業廢水中Cd2+具有潛在的可能性。

表3 固定化微生物吸附Cd2+的動力學參數

圖8固定化小球對Cd2+的解吸附率

Figure 8 Percentage desorption of Cd2+by immobilized beads

圖9 固定化小球的實際廢水應用

3 結論

1)在NCBI數據庫中對SH-1菌株的16S rRNA基因進行BLAST同源性比對，發現其與C.rhizosphaeraeRSB3-1T的同源性為99.3%，證實該菌株為根際金黃桿菌屬，將其命為C.rhizosphaeraeSH-1。

2)固定化的內生菌SH-1在Cd2+初始濃度為100 mg/L，吸附時間為480 min，溶液pH 5條件下，對Cd2+的去除率高達93.24%。

3)吸附動力學擬合結果表明，準二級動力學能較好地擬合固定化SH-1小球對重金屬Cd2+的吸附過程。吸附等溫模型結果表明，Langmuir模型更能準確地描述小球對Cd2+的吸附過程，其吸附過程主要為單分子吸附。

4)解吸結果表明，固定化SH-1小球可高效反復的吸附溶液中重金屬離子，在3次循環之后其解吸附率仍在90%以上，且小球完好無損便于回收利用。