嗜熱酯酶的研究進展

李婷婷， 張天喜， 武俊明， 陳華友

(1.江蘇大學 生命科學研究院， 鎮江 212000; 2.江蘇中興藥業有限公司， 鎮江 212000)

近年來，生物催化憑借其溫和的作用條件，獨特高效的底物選擇性等特點，普遍應用于生物化工領域[1]。酯酶是一類水解酶，能夠在水分子的作用下將酯類裂解成酸和醇，完成酯化、酯交換等重要反應，這些酶基于它們的特異性受體、蛋白質結構和功能而變化，廣泛用于工業酶催化。

通過微生物發酵的方法生產酯酶具有價格低廉、原料豐富、方法簡單等優點，而大多數工業生產使用的酯酶屬于嗜溫微生物，在高溫、高堿等惡劣的工業環境中極不穩定乃至喪失活性[2]，這就使嗜溫酯酶的應用受到了一定的局限。嗜熱酯酶指最適生長溫度在60 ℃以上的酶類，它融合了嗜熱酶和酯酶的基礎特征，在極端的自然環境下仍能保持較好的熱穩定性和化學穩定性，在生物催化領域越來越受到重視[3]。

1 嗜熱酯酶的來源

1.1 利用定向分子進化技術改造常溫酯酶得到嗜熱酯酶

定向進化是提高蛋白功能與活性的有效途徑。在確保酶穩定性的基礎上，利用分子修飾來增強催化活性成為得到理想酶的新方法[4]。利用定向進化技術對嗜熱酯酶進行改造能夠提高重要功能性非天然化合物的催化性能[5]。例如，Adesioye等[6]應用定向進化技術改造乙酰木聚糖酯酶的底物特異性。Liu等[7]通過定向進化得到活性較高、底物特異性較廣泛、熱穩定性較好的突變體擬除蟲菊酯水解酯酶。此外，利用DNA改組技術重組相關基因的片段來產生新的基因庫，再通過篩選也可獲得新的嗜熱酯酶。

1.2 利用基因組克隆與表達技術大量表達嗜熱酯酶

隨著全基因組測序技術的發展，應用生物信息學技術分析獲得疑似嗜熱酯酶序列，再通過分子克隆技術擴增并表達出該蛋白，然后對該序列進行性質分析，能很快得到新型嗜熱酯酶。通過該方法獲得的嗜熱酯酶與自然界中的其他酯酶不同，如來自T.Maritima的酯酶TM0033、TM0036，最適溫度為95 ℃[8]，且擁有很好的熱穩定性。另外，來自Ureibacillusthermosphaericus的酯酶estUT1[9]在有機溶劑中表現出很高的穩定性和對有機溶劑的耐受性。此類耐熱酯酶因其特殊的環狀結構以及基因組易提取和克隆的特性，為工業生產提供了一定的參考。目前，已有多數嗜熱酯酶被分離鑒定出來(表1)。

表1 嗜熱酯酶的研究進展

2 嗜熱酯酶的耐熱機制

嗜熱酯酶的催化功能和耐受性在高溫條件下更突出，因此嗜熱酯酶比嗜溫酯酶具有更多優點，如發酵溫度高，從而減少了雜菌的污染；在高溫下無機鹽增加了離子作用，有利于生物量的提高；穩定性好，酶解反應速率快，易于在室溫下保存等[15]，因此在工業生產中有著較好的應用潛能。

2.1 蛋白質的氨基酸組成

嗜熱酯酶中的部分氨基酸如半胱氨酸、谷氨酰胺、絲氨酸等，在高溫條件下會發生氧化水解、二硫鍵相互轉化等共價修飾作用；帶有支鏈的氨基酸如纈氨酸、蘇氨酸等在螺旋的排布中會有較多的限制，所以這些氨基酸在嗜熱酯酶中較少出現，約占10%；而脯氨酸、精氨酸、谷氨酸含量較高，約占32.5%，因為脯氨酸的特殊結構，在組成蛋白時比較容易折疊，但折疊后若需要解折疊則要更高的能量，因而富含脯氨酸的蛋白質熱穩定性較高[16]；而精氨酸和谷氨酸相比帶同種電荷的氨基酸側鏈結構更大，而且側鏈提供的離子相互作用和疏水相互作用也有利于蛋白質熱穩定性的提高。

2.2 蛋白質的天然構象

嗜溫酯酶與嗜熱酯酶的序列同源性較高，但兩者形成蛋白質高級結構的非共價作用力不同，嗜熱酯酶更傾向于形成高穩定性和催化活性的高級結構。從晶體結構的角度分析，驅動蛋白質折疊形成空間結構的主要力量是疏水作用，它為蛋白質在水溶液中的折疊提供能量。而離子對超嗜熱蛋白的穩定性起重要作用，它能夠穩定二級結構以及加強其剛性[17]。通過上述分析，來源于嗜熱微生物的蛋白通常具有耐熱的初級結構，還有形成高級結構的疏水力，即便在體外的紛繁復雜的環境中仍能維持較好的耐熱性；因此選擇嗜熱酯酶應用于生物催化領域，具有事半功倍的效果。

2.3 環境因素

大部分嗜熱酯酶本身具備熱穩定性，另外還有少數菌體內的嗜熱酯酶經菌體內環境因素增強其耐熱性。某些金屬離子如Ca2+、Mg2+、K+以及Zn2+等[18]也可以提高大多數酶的耐熱性。蛋白酶易失活，在應用上有一定的局限性，而來自嗜熱菌的嗜熱蛋白酶優點顯著。如Habib等[19]從溫泉中分離出兩種新的嗜熱菌(Tepidimonassediminissp.nov.andTepidimonasalkaliphilussp.nov.)，具有較高的熱穩定性。分子伴侶與細胞內蛋白的折疊與裝配緊密相連，它可以在生長溫度達到最高且靠近胞內蛋白質與酶的變性溫度時，通過重折疊保護其他蛋白質和酶的活性，這種保護形式使嗜熱微生物能夠習慣在高溫環境下生存。

3 嗜熱酯酶的固定化

酶的固定化技術是通過物理方法或化學方法連接游離酶和相應載體，進而加強酶的穩定性的一類技術(表2)，在工業生產實際中發揮著重要作用[20]。固定化酶應用于生物催化過程有較大優勢，主要是由于固定化的生物催化劑能反復使用，穩定性更高，后處理工藝簡單，生產效率大大提高；然而該技術有著不容忽視的弊端：酶在固定化過程中費用昂貴且比較費時，循環利用時酶活力會受到損失等。

表2 嗜熱酯酶不同固定化方式的比較

有關嗜熱酯酶的固定化報道較多，如Huttner等[26]研究了4種酯酶在嗜熱真菌中的固定化，并通過物理吸附在不同孔徑的二氧化硅顆粒上進行了優化。Ren等[27]利用共價連接成功地將嗜熱酯酶AFEST固定在環氧載體EC-EP上，并將固定化酶作為生物催化劑用于制備ε-己內酯，通過系統研究該酶，發現固定化酶EC-OD-AEFST具備較好的熱穩定性和操作穩定性。然而，這些固定化方法通常操作過于繁瑣且成本較高，因此迫切需要新型的酶固定化方式。

近些年枯草桿菌芽孢衣殼蛋白作為良好的分子載體備受研究人員的青睞。該芽孢展示系統利用共價固定與芽孢吸附等作用，將外源蛋白展示在芽孢表面而不需要通過跨膜運輸，因此利用該展示系統可以較容易地把大分子蛋白展示在芽孢表面(圖1)[28]。此外，枯草芽孢桿菌具備特殊的抗逆性和益生性，并且耐高溫、強堿等惡劣環境，回收利用方法簡單，明顯節約了工業成本。該展示系統也是具有強抗逆性的酶的良好固定化載體，高溫環境的利用對耐熱性酯酶有一定的借鑒意義。

圖1 枯草桿菌芽孢表面展示酶示意圖

4 嗜熱酯酶的主要應用

目前很多酯酶已經商品化，廣闊的應用前景使該類酶遍及多種行業。如Whiteley等用嗜熱酯酶催化合成生物柴油[29]，獲得期望結果。生物柴油與普通的油料相比，燃燒更充分，且無鉛，對環境影響小。研究表明，嗜熱酯酶最有價值的工業屬性表現如下：1)高穩定性。能夠在室溫下分離、純化、包裝和運輸，嗜熱酯酶作為催化劑時，其環境溫度正常大于45 ℃[30]，所以這類酶在45 ℃以上穩定性較好。2)在有機試劑中有較好的穩定性和活性。用有機試劑代替水作為生物催化劑有助于疏水性底物的反應、產品的回收、酶熱穩定性的提高、防止由水引起的副反應等[27]。因此，有機溶劑有助于嗜熱酯酶活性的保持，在工業生物催化等方面發揮著重要作用。3)耐鹽性。嗜鹽微生物的酯酶尚未全面開發，它們對變性鹽的作用有很好的抗性。根據以上描述分析可知，具有多重性質的酯酶在工業領域應用更為廣泛，相對于其他類型的酯酶，嗜熱酯酶具備較高的熱穩定性和底物特異性，因此在工業應用中具有獨特的優勢。基于工業生物催化劑的重要性，深入研究具有新型特征組合的酶對工業的發展具有重要作用。

5 展望

近年來，隨著定向進化、固定化等技術的發展，研究人員發掘了大批具有應用潛力的嗜熱酯酶，進一步研究了其耐熱機制并獲得了顯著成效，為以后嗜熱酯酶的改造以及產業化生產提供了堅實的理論依據。但同時也發現了一系列的問題，諸如仍有多數嗜熱酯酶有待開發；嗜熱酯酶的穩定性是否受其剛性和柔性的影響尚不可知；還原劑對嗜熱酯酶活性的影響因素、嗜熱酯酶的其他催化作用以及該酶的工業化應用領域等，有待進一步探索。

后續關于嗜熱酯酶的研究可以從以下幾個方面進行探索：結構學上研究DTT(DL-Dithiothreitol,二硫蘇糖醇)對嗜熱酯酶活性影響的機制，雖然有文獻報道嗜熱酯酶有很好的耐熱性，但很少有文獻報道從結構上探索嗜熱酯酶的耐熱性機制；此外，還可以通過響應面方法(RSM)對插入連接肽的重組酯酶的性質進行分析；也可以從融合蛋白結構上分析插入連接肽后對展示的嗜熱酯酶活性影響的機制，這些將是今后研究嗜熱酯酶的熱點。