騰沖嗜熱厭氧桿菌ahpC編碼基因的克隆表達及生物信息學分析

鄭航輝, 高 昇, 楊宇澤, 吳 潤, 萬學瑞, 王 川, 劉 磊

(1. 甘肅農業大學 動物醫學學院， 蘭州 730070； 2. 北京市畜牧總站， 北京 100101)

騰沖嗜熱厭氧桿菌MB4是1998年我國科學家從云南騰沖縣的熱泉里分離出的一株嗜熱厭氧菌株，在50 ℃到80 ℃之間生長，最適生長溫度是75 ℃[1]，同時也是我國第一個完成全基因組測序和基因注釋的原核微生物[2]。為什么嗜熱菌可以在相對苛刻的條件下生長和繁殖？研究者從不同的角度對嗜熱菌的嗜熱機制進行了廣泛而深入的探究，所涉及的方面包括嗜熱菌的細胞膜的結構和流動性以適應高溫[3-5]、蛋白質的熱穩定性以及蛋白質對高溫的適應[6-9]、酶的結構和功能及金屬離子的保護作用等[10]。此外，截至2017年超過80株嗜熱微生物的全基因組序列被發布，通過比較嗜熱菌和常溫細菌的生物學信息，分析嗜熱機制也是一個研究方向，包括基因組的GC含量[11]；氨基酸的組成和使用頻率[12-13]等。雖然嗜熱菌單一因素的嗜熱機制被廣泛研究，但由于細菌的生命活動在很大程度上是一個很復雜的分子網絡，因此對嗜熱微生物嗜熱機制進行更廣泛和深入地分析不僅有助于我們對原始地球環境的理解以及生物進化機制的研究，而且還能促進一些耐熱蛋白、耐熱酶等活性物質在工業、農業和醫藥等領域的應用。

AhpC是一種硫氧還原蛋白依賴的烷基過氧化氫還原酶，能夠還原有毒的氫化氧化物[14]。AhpC是細菌清除自由基的一種主要成分，如果烷基過氧化氫還原酶基因功能缺陷就會導致包括形態學和細胞表面性質在內的表型改變[15]。AhpC可以催化減少過氧化氫和過氧化物，參與到冷壓力或熱壓力反應過程中[16]。依據測序完成的基因組數據和已發現AhpC家族的其他生物學信息，騰沖嗜熱厭氧菌基因tte0270被注釋為ahpC的一種。我們通過使用騰沖嗜熱厭氧基因組作為模板克隆ahpC并體外表達AhpC，希望使用生物信息學手段來分析AhpC在騰沖嗜熱厭氧桿菌嗜熱性中發揮的作用，希望為日后研究騰沖嗜熱菌的嗜熱機制提供重要的信息，為嗜熱機制的闡明奠定良好的工作基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質粒

質粒pET-28a，感受態菌E.ColiBL21 (DE3)和E.coliDH5α為本實驗室保藏；騰沖嗜熱厭氧桿菌MB4菌株由中國科學院微生物研究所譚華榮研究員惠贈。

1.1.2 培養基

騰沖嗜熱厭氧桿菌培養基(TTE培養基)用于騰沖嗜熱厭氧桿菌培養[17]；2×YT培養基用于重組菌的誘導，LB培養基用于大腸桿菌DH5α、BL21(DE3)的培養。

1.1.3 主要試劑

XhoⅠ、RNase Inhibitor、BamHⅠ、DNase I、T4 DNA Ligase購自大連寶生物工程公司； IPTG、卡那霉素、FastPfu fly DNAPolymerase均購自TransGen Biotech有限公司；反轉錄酶Super Script Ⅲ購自Invitrogen；質粒DNA小提試劑盒、基因組DNA提取試劑盒、PCR產物純化試劑盒購自TIANGEN公司；鎳離子親和柱購自GE公司；超純RNA提取試劑盒購自北京康為世紀生物科技有限公司；熒光定量PCR試劑盒購自Roche公司。其他試劑購自國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 引物設計

參照GenBank中騰沖嗜熱菌MB4(AE008691.1)ahpC在GenBank中的序列設計引物，并送金唯智科技有限公司合成。引物序列如下：ahpC-F:5′-CGCGGATCCATGGAGGAAATTAG-3′(下劃線為BamHⅠ酶切位點)；ahpC-R:5′-CCGCTCGAGTTTCAAAGGTTTGTGTACG-3′(下劃線為XhoⅠ酶切位點)。

1.2.2 騰沖嗜熱厭氧桿菌基因組DNA的提取

在TTE培養基中75 ℃培養騰沖嗜熱厭氧桿菌，使用試劑盒提取嗜熱菌基因組DNA。

1.2.3ahpC基因的擴增

以提取的基因組DNA為模板進行擴增。反應條件為：95 ℃預變性6 min；95 ℃變性35 s，50.7 ℃退火45 s，72 ℃延伸2 min，共35個循環。將ahpC和pET-28a雙酶切，16 ℃連接，將其轉化到DH5α中，提取質粒，雙酶切判定，測序正確后，將其定名為pET-28a::ahpC。

1.2.4 AhpC蛋白的表達及純化

將pET-28a::ahpC轉化至感受態BL21(DE3)中，表達及純化方法參照文獻[18]。為分析AhpC蛋白表達情況，以誘導前、后的菌液作為對照進行SDS-PAGE電泳。

1.2.5 RNA提取及實時定量RT-PCR

ahpC上游引物：5′-CGACTGAAAGCCCAATGAGT-3′，下游引物5′-GCAGGAAAATGGTTTGTGCT-3′；16sRNA上游引物：5′-CGTAGGCGGTTTAGCAAGTC-3′，下游引物：5′-CTACGCATTTCACCGCTACA-3′。

分別在50 ℃、60 ℃、75 ℃和80 ℃培養厭氧桿菌。RNA提取及RT-PCR方法參照文獻[17]。以16s RNA作為內參基因，采用相對定量的方法檢測了50 ℃、60 ℃、75 ℃和80 ℃下騰沖嗜熱菌ahpCRNA的表達量變化。反應結束后對 Ct 值采用 2-ΔΔCt法進行定量分析。分別對每個溫度的 3 個生物學重復數據進行分析，使用 SPSS 軟件進行 ANOVA單因素方差分析，P<0.05，表示有顯著性差異。

1.2.6ahpC序列的生物信息學分析

選擇騰沖嗜熱厭氧桿菌(AE008691.1)、嗜冷菌單核細胞增生李斯特菌(NC_017537.1)、常溫菌大腸桿菌(NC_000913.3)的ahpC基因序列，使用在線軟件Prot-Param分析騰沖嗜熱菌、大腸桿菌和李氏桿菌基因序列編碼氨基酸序列組成及其理化性質[30]；使用在線軟件 ProtScale分析3種AhpC蛋白疏水性；使用在線軟件 TMHMM v.2.0預測騰沖嗜熱厭氧桿菌AhpC蛋白跨膜區；使用在線軟件 PORTER來預測騰沖嗜熱菌的AhpC蛋白二級結構；使用程序SignalP 3.0 Server分析騰沖嗜熱厭氧桿菌AhpC蛋白信號肽；使用在線軟件SWISS-MODEL/ SWISS-PdbView等，按照同源建模法構建出騰沖嗜熱菌、大腸桿菌和李氏桿菌菌株AhpC蛋白的三級結構。

2 結果與分析

2.1 ahpC的PCR擴增結果及pET-28a::ahpC重組質粒酶切驗證

經PCR擴增出的ahpC片段與已知的目的基因片段長度相符(圖1)，測序結果表明ahpC大小為663 bp。

M：DNA分子質量標準DL 5000；1：pET-28a::ahpC雙酶切；2：pET-28a質粒雙酶切；3：ahpC基因PCR產物

M:DL 5000 DNA Marker; 1：Double endonuclease digestion product of pET-28a::ahpC; 2:Double endonuclease digestion product of pET-28a; 3：PCR products ofahpC

圖1ahpC的PCR擴增產物及pET-28a::ahpC重組質粒雙酶切

Figure 1 Electrophoresis of PCR products of objective gene and pET-28a::ahpCrecombinant plasmid digested

2.2 AhpC蛋白的純化

通過SDS-PAGE 發現，誘導后菌體沉淀出現特異性條帶，而誘導前菌體沉淀無特異條帶，純化后在25～35 ku之間出現單一條帶，AhpC蛋白大小符合預期(圖2)。

M：蛋白分子質量標準；1、2、3：純化后的 pET28a-AhpC表達蛋白；4：誘導后的pET28a-AhpC菌液；5:未誘導的pET28a-AhpC菌液

M：Protein molecular weight Marker；1，2，3：Purification recombinant expressed protein pET-28a::ahpC；4：pET-28a::ahpCinduced with IPTG ；5：pET-28a::ahpCnot induced with IPTG

圖2AhpC表達產物的SDS-PAGE

Figure 2 SDS-PAGE analysis of the AhpC expressed product

2.3 ahpC在不同溫度下的轉錄分析

將50 ℃的表達量定義為1，結果顯示：在60 ℃、75 ℃和80 ℃表達量是相對于50 ℃表達量的3.9倍、13.6倍和26.5倍(圖3)。明顯看出隨著溫度的升高ahpC表達量增高，ahpC的表達與溫度呈正相關。

16S RNA作為內參基因，50 ℃時ahpC表達量作為1

16SrRNA was used as internal control, and the transcription at 50 ℃ was arbitrarily assigned as relative 1

圖3ahpC在50℃、60℃、75℃和80℃下的轉錄分析

Figure 3 Relative transcriptional level ofahpCunder 50 ℃, 60 ℃, 75 ℃ and 80 ℃

2.4 騰沖嗜熱菌ahpC及AhpC的生物信息學分子特征

2.4.1ahpC序列及AhpC氨基酸序列的分子特征

通過在線程序EXPASY分析得到騰沖嗜熱菌ahpC基因全長663 bp,其中A堿基146個(22.0%)、T堿基243個(36.7%)、G堿基125個(18.9%)、C堿基149個(22.5%)，AhpC編碼220個氨基酸，AhpC分子質量約為26 ku，等電點(pI)為6.126，分子式為C1158H1795N299O323S7。通過生物信息學分析比較了ahpC在騰沖嗜熱菌、大腸桿菌以及李氏桿菌所編碼氨基酸的基本理化性質，結果發現：騰沖嗜熱菌AhpC中脯氨酸含量比大腸桿菌高1.3%，比李氏桿菌高1.3%；騰沖嗜熱菌AhpC中Arg和Lys含量分別為4.1%和8.6%，大腸桿菌為3.2%和7.5%，李氏桿菌為2.7%和4.8%；騰沖嗜熱菌AhpC中Cys含量為0.5%，大腸桿菌為1.1%，李氏桿菌為2.1%。騰沖嗜熱厭氧桿菌AhpC中Leu含量為7.3%，Ile為6.8%，大腸桿菌和李氏桿菌中均為7.0%和5.9%。騰沖嗜熱菌AhpC中Cys含量為0.5%，大腸桿菌為1.1%，李氏桿菌為2.1%(表1)。

2.4.2ahpC編碼蛋白質的疏水性分析

疏水性對蛋白三級結構的構成和穩定具有關鍵作用，在線程序ProtScale對AhpC的氨基酸序列進行疏水性分析，蛋白疏水性平均值為-0.272，最大值為1.700，最小值為-2.311,不穩定系數(instability index)為31.99，脂肪系數為89.00，表明為親水蛋白。潛在疏水區分別位于16～17、34～42、45～47、49～53、69～79、81～82、95～105、111～112、124～140、142、153～160、166～167、181～184、186～188位aa。其中疏水性最強的是位于第95～105位的氨基酸。

表1 ahpC在騰沖嗜熱菌、大腸桿菌以及李氏桿菌所編碼氨基酸的基本理化性質

2.4.3 AhpC跨膜區、信號肽位點的預測

經過預測騰沖嗜熱菌的AhpC蛋白沒有跨膜結構，也不存在信號肽位點。

2.4.4 AhpC蛋白二級結構和AhpC三級結構特征預測

應用Predict Protein 工具分析顯示：利用在線程序PORTER軟件預測AhpC的二級結構，結果如圖4所示，有64個(19.1%)氨基酸殘基參與形成α-螺旋，有99個(45%)氨基酸殘基組成無規則卷曲結構(Random coil)，有57個(25.9%)氨基酸殘基參與構成β-折疊。同時對AhpC在騰沖嗜熱菌、大腸桿菌、李氏桿菌中編碼蛋白二級結構氨基酸殘基進行比較結果如表2所示。使用在線軟件 SWISS-MODEL/SWISS-PdbView 等，根據同源建模法預測出ahpC在騰沖嗜熱菌、大腸桿菌以及李氏桿菌所編碼蛋白的三級結構。如圖5所示，騰沖嗜熱菌的AhpC的三級結構比其他兩種菌株更緊湊。

H：α-螺旋；C：無規卷曲；E：β-折疊

H：Α-helix；C：Random coil；E：β-extension

圖4騰沖嗜熱厭氧桿菌AhpC蛋白二級結構的預測
Figure 4 Prediction of secondary structure of AhpC ofThermoanaerobactertengcongensis

3 討論

蛋白質的熱穩定性是研究嗜熱微生物嗜熱機制的熱點和關鍵。通過熒光定量PCR分析發現隨著溫度升高ahpCmRNA表達量顯著升高，Liu等人[19]發現敲除ahpC會導致騰沖嗜熱厭氧桿菌死亡，我們推測ahpC編碼蛋白在騰沖嗜熱厭氧桿菌嗜熱過程中起到重要作用。

表2 ahpC在騰沖嗜熱菌、大腸桿菌以及李氏桿菌所編碼蛋白二級結構比較

A、B和C分別代表AhpC在騰沖嗜熱厭氧桿菌、大腸桿菌和單核細胞增生李斯特菌中編碼蛋白三級結構預測

A, B and C were the representative of AhpC in the three level structure prediction of the coding protein ofThermoanaerobactertengcongensis,EscherichiacoliandListeriamonocytogenes

圖5AhpC三級結構預測

Figure 5 Prediction of tertiary structure of AhpC

使用生物信息學分析ahpC在騰沖嗜熱厭氧桿菌、大腸桿菌和李氏桿菌中編碼蛋白的理化性質，發現3個菌株在CG含量、氨基酸組成、蛋白質結構方面有明顯差異。蛋白質中各種氨基酸殘基的含量和分布會對極端嗜熱蛋白質熱穩定性產生影響。研究發現氨基酸側鏈對蛋白質的嗜熱性質可能起決定性作用[20]。脯氨酸(Pro)具有最低的構象熵[21]；半胱氨酸(Cys)在高溫條件下易發生氧化作用；堿性氨基酸賴氨酸(Lys)和精氨酸(Arg)均參與離子鍵的形成，并且在高溫條件下精氨酸所參與形成的離子鍵熱穩定性更強[22]。將騰沖嗜熱菌的AhpC與來自常溫菌的大腸桿菌和來自嗜冷菌的李氏桿菌的AhpC氨基酸序列進行比較發現，騰沖嗜熱菌AhpC中Pro、Arg含量高于大腸桿菌和李氏桿菌AhpC中的含量，而Lus、Cys含量比大腸桿菌和李氏桿菌低。蛋白質的疏水性在促進蛋白質熱穩定性中也起到了關鍵作用。研究發現亮氨酸(Leu)和異亮氨酸(Ile)的側鏈疏水性最強，而較大的疏水作用可以使肽鏈折疊成更加緊密的結構，這有利于蛋白質的熱穩定性[23]，而騰沖嗜熱菌AhpC中Leu和Ile 含量高于在大腸桿菌和李氏桿菌AhpC中的含量。

騰沖嗜熱菌AhpC不存在跨膜區域，說明該蛋白可能是非表面結構蛋白，也不存在信號肽，表明AhpC為非分泌蛋白。蛋白質的二級結構作為一級結構和三級結構之間的樞紐，是預測蛋白質三級結構的關鍵點，經過預測騰沖嗜熱菌AhpC屬于混合型蛋白[24]。較多的α-螺旋氨基酸殘基的存在有利于蛋白結構的穩定[25]，并且α-螺旋結構的形成會使蛋白分子表面 loop結構長度縮短，有利于提高蛋白分子的熱穩定性[26]，而α-螺旋在騰沖嗜熱菌AhpC中含量高于大腸桿菌和李氏桿菌。對騰沖嗜熱菌、大腸桿菌和李氏桿菌的三級結構預測，發現騰沖嗜熱菌的AhpC蛋白三級結構明顯比另外兩種菌株更緊湊，這有利于蛋白質分子的穩定。

本研究發現騰沖嗜熱菌ahpC表達量與溫度呈正相關，并進一步利用生物信息學分析了AhpC蛋白熱穩定性高于大腸桿菌和李氏桿菌的AhpC蛋白的原因。騰沖嗜熱厭氧桿菌中AhpC的存在明顯增強了其環境適應性。本研究為未來騰沖嗜熱菌的嗜熱機制的闡明提供重要的信息，為嗜熱機制的研究奠定了良好的工作基礎。