低溫馴化對斑馬魚胚胎發(fā)育和mtDNA拷貝數(shù)的影響

冉皓宇, 陳良標

(1. 海洋生物科學(xué)國際聯(lián)合研究中心(上海海洋大學(xué)) 中國科學(xué)技術(shù)部, 上海 201306; 2. 水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點實驗室(上海海洋大學(xué)), 上海 201306; 3. 水產(chǎn)科學(xué)國家級實驗教學(xué)示范中心(上海海洋大學(xué)), 上海 201306)

水溫是決定魚類幾乎所有生命活動的主要因素，影響魚類的生長[1]、發(fā)育、繁殖、代謝以及地理分布[2]。和大多數(shù)變溫動物一樣，魚類也可能會面臨短時間內(nèi)或者季節(jié)性的溫度變化，如果水溫的變化超過了其特定的熱容差范圍，會對魚類造成不利的影響。自然條件下，長時間暴露在超出耐受范圍的低溫條件下，是大多數(shù)魚類死亡的本質(zhì)原因[3]。因此，研究魚類應(yīng)對低溫刺激的能力對于魚類的生存就顯得至關(guān)重要。近年來有不少研究表明，溫度馴化可以改變魚類的生理活動和組織形態(tài)，進而去適應(yīng)更低的溫度。通過低溫馴化的手段可以增強魚類心臟收縮次數(shù)，抵消血液黏稠的壓力[4]，改變代謝酶活性和游泳速度[5]，同時會導(dǎo)致心臟[6]和肌肉等組織發(fā)生重塑[7]。然而，我們所知道的馴化對魚類的影響及其機制研究，主要對象都是幼年期或者成年期的動物，而長期的溫度馴化對魚類早期胚胎發(fā)育的影響則鮮有研究。

魚類胚胎的早期發(fā)育過程非常復(fù)雜，包括了細胞分裂與分化、細胞運動、胚層形成和器官形成等生物過程[8]。在這個過程中涉及基因的表達，多種信號通路的協(xié)調(diào)互作。無論是在細胞層面還是在基因?qū)用妫撾A段的生物活動需要及時的能量供應(yīng)[9]。線粒體是真核細胞進行氧化磷酸化的重要細胞器，合成ATP，為生命活動提供能量，同時在細胞凋亡和死亡過程中也發(fā)揮著重要的作用[10]。卵母細胞的受精和早期胚胎的發(fā)育潛力都受到線粒體數(shù)量的影響[11]。線粒體數(shù)量可以作為評價卵母細胞和早期胚胎質(zhì)量的重要標志[12]。通過實時熒光定量PCR的方法對線粒體DNA(mtDNA)進行定量是測定線粒體數(shù)量的有效方法[13]。

在本研究中，我們選擇模式生物斑馬魚進行馴化實驗，構(gòu)建斑馬魚低溫馴化模型。正常情況下，斑馬魚發(fā)育溫度為27 ℃左右，其所產(chǎn)的胚胎半致死溫度(死亡率50%)為22 ℃，臨界致死溫度(死亡率100%)為20 ℃。通過對常溫27 ℃發(fā)育至性成熟的斑馬魚進行22 ℃低溫馴化，觀察其胚胎的低溫發(fā)育潛能和mtDNA含量的變化，進而探究在斑馬魚中，對親本的馴化是否能使其早期胚胎發(fā)育產(chǎn)生相應(yīng)的低溫耐受性，并進一步探討其早期胚胎發(fā)育的低溫耐受性與線粒體數(shù)量之間的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

DNA抽提試劑盒(碧云天)；瓊脂糖凝膠回收試劑盒(OMEGA)；質(zhì)粒小提試劑盒(OMEGA)；T-Vector pMD19 (Simple) (Takara)；NanoDrop2000分光光度計(Thermo Fisher)；實時熒光定量PCR儀(Bio-Rad)。

1.2 供試材料

本研究中的斑馬魚為 AB品系的野生型斑馬魚，來源于中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所， 飼養(yǎng)的最適宜水環(huán)境為27 ℃～28.5 ℃：培養(yǎng)水溫為27 ℃，pH 7～8，鹽度450～550 μS；通過自動光照系統(tǒng)控制光照周期，分別為明14 h、暗10 h。

1.3 方法

1.3.1 低溫馴化斑馬魚

取來自于相同親本，27 ℃正常孵化的6月齡野生型斑馬魚，均分為2組，每組中保證雌雄比例為1∶1。其中一組在27 ℃正常養(yǎng)殖，作為未馴化對照組，稱為TE27(The temperature 27 ℃)。另一組，移入恒溫培養(yǎng)箱中，以每小時1 ℃的速率，逐漸降溫至22 ℃持續(xù)養(yǎng)殖，稱為TA22(Acclimaion temperature 22 ℃)。持續(xù)養(yǎng)殖期間，每個培養(yǎng)箱中放置8個3 L的中型斑馬魚養(yǎng)殖缸，缸中含水量為2 L。每缸養(yǎng)殖8條斑馬魚，雌雄斑馬魚各4尾。每個缸中，分別加入充氣石，保證水中的溶氧。每天早晚各過量投喂1次豐年蟲，保證斑馬魚飽食。光暗比例為14 h∶10 h，每天8:00開啟培養(yǎng)箱關(guān)照燈，22:00關(guān)閉培養(yǎng)箱關(guān)照燈。在晚上投喂3 h后，取27 ℃養(yǎng)殖斑馬魚的水體，使用冰塊(循環(huán)水體-40 ℃凍結(jié))調(diào)節(jié)水溫至各個馴化溫度(22 ℃及20 ℃)。在室溫下，迅速給各個養(yǎng)殖缸換水，使用毛刷清除缸壁和缸底的殘食和黏著物，保證水體新鮮，各項理化指標與TE27對照組一致。

1.3.2 繁殖及耐寒性統(tǒng)計

當(dāng)馴化6個月后，將馴化組的斑馬魚TA22和未馴化對照組斑馬魚TE27，在其養(yǎng)殖溫度下，以雌雄比例1∶1的比例配對放入繁殖缸中。次日8：00開啟培養(yǎng)箱光照燈后0.5 h，使斑馬魚互相追逐、交配、產(chǎn)卵。產(chǎn)卵后10 min內(nèi)，收集斑馬魚胚胎至10 cm培養(yǎng)皿中，使用養(yǎng)殖溫度對應(yīng)溫度的E3培養(yǎng)基清洗后，在22 ℃和20 ℃發(fā)育，檢測耐寒性并統(tǒng)計成活率。

1.3.3 DNA提取

于0 hpf(hour post-fertilization)、8 hpf、12 hpf和24 hpf 4個發(fā)育時期收集未馴化組TE27及馴化組TA22的胚胎并提取DNA(包含mtDNA)。兩組均分別從3對親魚所產(chǎn)的胚胎中取樣，其中0 hpf 100枚胚胎，8、12和24 hpf均為20枚胚胎。所提取的DNA溶于ddH20，瓊脂糖凝膠電泳檢測完整性，將濃度調(diào)至一致，-20℃保存?zhèn)溆谩Ｍ瑫r提取野生型斑馬魚基因組DNA，用于絕對定量標準品的制備。

1.3.4 PCR引物設(shè)計與合成

選擇線粒體DNA上的mt-nd4，mt-cytb作為目的基因，單拷貝基因actb1作為對照。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.3.5 實時熒光PCR標準品的制備

以野生型斑馬魚總DNA為模板，通過PCR反應(yīng)得到線粒體特有基因mt-nd4，mt-cytb以及單拷貝基因actb1的PCR產(chǎn)物。膠回收獲取上述基因PCR純化產(chǎn)物，通過T-Vector pMD19 (Simple)載體進行克隆。轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細胞后，37 ℃培養(yǎng)過夜，挑取陽性克隆，經(jīng)PCR和DNA測序鑒定后，篩選出目的質(zhì)粒。進行質(zhì)粒小提并測定濃度。

1.3.6 mtDNA相關(guān)基因定量絕對定量

將獲得的質(zhì)粒等比例梯度稀釋(10倍)獲得6個梯度的標準品，并利用標準品繪制標準曲線。使用熒光定量PCR儀對mtDNA上的mt-nd4，mt-cytb基因以及單拷貝基因actb1進行定量。反應(yīng)體系20 μL：SYBR Green mix 10 μL，胚胎DNA 1 μL，正向引物(10 μmol/L) 1 μL，反向引物(10 μmol/L) 1μL，ddH2O 7 μL)反應(yīng)條件：95 ℃ 預(yù)變性5 min；95 ℃ 變性10 s, 60 ℃退火10 s, 72℃延伸30 s, 40個循環(huán)；溶解曲線95 ℃ 10 s，65 ℃～95 ℃ 0.5 ℃/s升溫。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均用平均值±標準差(x±s)表示，數(shù)據(jù)使用Excel 2013，GraphPad Prism 5，Bio-Rad CFX Manager分析和制圖。拷貝數(shù)計算公式為：

DNA 拷貝數(shù)(copies/μL)=(6.02×1023)×(ng/μL×10-9) / (DNA堿基數(shù)×660)

單細胞中DNA拷貝數(shù)=mt-nd4/actb1

2 結(jié)果和分析

2.1 低溫馴化組胚胎低溫發(fā)育能力

如圖1所示，將低溫馴化組TA22斑馬魚所產(chǎn)的胚胎和未馴化組TE27斑馬魚胚胎放入22 ℃(半致死溫度)發(fā)育至出膜，TA22斑馬魚所產(chǎn)的胚胎成活率約為90%，而TE27斑馬魚所產(chǎn)的胚胎成活率約為60%，二者差異明顯(P<0.01)。同時將低溫馴化組TA22斑馬魚所產(chǎn)的胚胎和未馴化組TE27斑馬魚胚胎放入20 ℃(臨界致死溫度)發(fā)育至出膜，TA22所產(chǎn)的胚胎可以在20 ℃存活，成活率約為50%而TE27斑馬魚胚胎全部死亡，成活率為0，二者差異顯著(P<0.001)。結(jié)果證明，通過對親本的長期低溫馴化，其所產(chǎn)胚胎的低溫發(fā)育能力增強，且可以突破正常溫度發(fā)育斑馬魚的臨界致死溫度20 ℃。但隨著發(fā)育溫度的降低，胚胎發(fā)育至出膜的時間增加。如表2所示，發(fā)育至出膜的時間隨著溫度的降低而不斷增加。

表2不同溫度斑馬魚胚胎發(fā)育時間

**：P<0.01，***：P<0.001

圖1低溫處理存活率統(tǒng)計

Figure 1 Low-temperature treatment survival

2.2 mtDNA拷貝數(shù)分析標準曲線

取用于制作標準曲線的目的質(zhì)粒為模板，行熒光定量PCR得到標準曲線, 每個梯度(包括平行孔)均有特征性擴增曲線, 呈明顯的S型; 根據(jù)104～109copies/μL標準品測得的熒光信號到達設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)(Ct)值繪制標準曲線。不同濃度標準定量的模板與Ct值呈直線相關(guān),如圖2-A所示mt-cytb標準曲線回歸方程為y=-3.664x+45.314, 其中y為Ct值,x為質(zhì)粒模板拷貝數(shù)以10為底的對數(shù), 相關(guān)系數(shù)為0.999，變異系數(shù)為0.8%。如圖2-B所示mt-nd4基因標準曲線回歸方程為y=-3.615x+43.959, 其中y為Ct值,x為質(zhì)粒模板拷貝數(shù)以10為底的對數(shù)，相關(guān)系數(shù)為0.999, 變異系數(shù)為1.6%。如圖2-C所示,單拷貝基因組基因actb1標準曲線回歸方程為y=-3.862x+43.959, 其中y為Ct值,x為質(zhì)粒模板拷貝數(shù)以10為底的對數(shù)，相關(guān)系數(shù)為0.999, 變異系數(shù)為2.1%。

圖2 標準曲線

2.3 斑馬魚0 hpf胚胎mtDNA數(shù)量

通過對TE27斑馬魚0 hpf胚胎和TA22斑馬魚0 hpf胚胎的mtDNA中2個不同的線粒體基因的定量發(fā)現(xiàn)(圖3)，TA22斑馬魚0 hpf胚胎mtDNA拷貝數(shù)約為2.43×104～2.83×104，而TE27斑馬魚0 hpf胚胎mtDNA拷貝數(shù)約為6.81×106～7.04×106，二者差異明顯(P<0.001)，TE27斑馬魚0 hpf胚胎mtDNA拷貝數(shù)約是TA22斑馬魚0 hpf胚胎的270倍。

2.4 斑馬魚胚胎線發(fā)育后期mtDNA數(shù)量

通過對TE27斑馬魚8 hpf、12 hpf和24 hpf胚胎和TA22斑馬魚8 hpf、12 hpf及24 hpf胚胎的mt-nd4基因的定量發(fā)現(xiàn)(圖4)，TE27斑馬魚8 hpf、12 hpf及24 hpf胚胎單個細胞中mt-nd4拷貝數(shù)平均值分別為453、243和150。TA22斑馬魚8 hpf、12 hpf及24 hpf胚胎單個細胞中mt-nd4拷貝數(shù)平均值分別為367、182和83。可見隨著胚胎的不斷分裂，胚胎中單個細胞的mtDNA拷貝數(shù)不斷降低，代表著單個細胞中線粒體數(shù)量在不斷減少。同時，TA22斑馬魚胚胎中mtDNA拷貝數(shù)仍小于TE27斑馬魚胚胎，雖然差異仍舊顯著(P<0.001)，但二者的數(shù)目逐漸接近。

圖3 斑馬魚0 hpf胚胎mtDNA拷貝數(shù)

圖4 斑馬魚胚胎發(fā)育后期mtDNA拷貝數(shù)

3 討論與結(jié)論

本實驗結(jié)果表明，對斑馬魚成魚的低溫馴化可以使其早期胚胎在低溫下具有更好地發(fā)育能力。在低溫下，馴化組斑馬魚早期胚胎的存活率與未馴化組斑馬魚早期胚胎相比顯著增高，同時，馴化組斑馬魚胚胎可以突破未馴化組斑馬魚胚胎發(fā)育的臨界致死溫度。因此可以推測，溫度馴化對于魚類早期胚胎的發(fā)育過程具有重要影響，包括改變早期胚胎的低溫耐受性，提高其低溫存活率等。目前，低溫馴化影響斑馬魚發(fā)育過程的具體機制尚不明確，本研究后續(xù)需要從分子水平上探究魚類低溫馴化以及低溫耐受的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。這為深入研究動物的進化以及生物體環(huán)境之間的關(guān)系提供了有價值的參考。

胚胎的發(fā)育能力與其線粒體的數(shù)量有著明顯的關(guān)聯(lián)，在合子基因尚未啟動的胚胎發(fā)育早期，mtDNA不復(fù)制，胚胎的耗能主要依賴于卵母細胞所攜帶的線粒體，線粒體的數(shù)量和卵子發(fā)生以及胚胎發(fā)育阻滯有著密切的聯(lián)系[14]。有研究表明，低水平的線粒體含量有助于卵母細胞的體外發(fā)育[15]，在小鼠[16]和牛[17]的體外胚胎發(fā)育過程中的線粒體數(shù)目減少。在胚胎發(fā)育后期，隨著合子基因的啟動，跟線粒體復(fù)制和分裂相關(guān)的核基因的表達，使得線粒體數(shù)量不斷增加，進而滿足發(fā)育后期對能量的需求，使得胚胎能夠繼續(xù)生長。隨著發(fā)育溫度的降低，發(fā)育的時間不斷延長，發(fā)育至合子基因啟動的時間延長，但胚胎單位時間的耗能會隨著減少，線粒體單位時間功能減少，相比于馴化組，未馴化組線粒體數(shù)量過剩。在南極魚類的研究中發(fā)現(xiàn)，低溫和酸化條件下線粒體具有一定的馴化潛能[18]。線粒體的功能可能在魚類生長發(fā)育過程中對溫度的適應(yīng)至關(guān)重要。研究表明，低溫會引起魚類體內(nèi)活性氧ROS(Reactive oxygen species)的相對增加，進一步引起線粒體損傷[19-20]，同時線粒體也介導(dǎo)了細胞內(nèi)氧化應(yīng)激的產(chǎn)生[21]。低溫也會引起細胞自噬并參與損傷線粒體的清除進而減弱細胞損傷[22]。馴化組胚胎在早期線粒體數(shù)量的減少，可能是胚胎發(fā)育早期能夠耐受低溫并發(fā)育的一個重要原因。

綜上所述，低溫馴化致使斑馬魚胚胎mtDNA拷貝數(shù)降低，代表著線粒體數(shù)量的減少。同時低溫馴化也提高了斑馬魚胚胎的低溫耐受性，但斑馬魚胚胎發(fā)育至出膜的時間延長。