CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)的斑馬魚kctd1純合突變體的構(gòu)建

劉 姣, 黃 姣, 胡金萌, 李偉明, 任建峰

(1. 海洋生物科學(xué)國際聯(lián)合研究中心(上海海洋大學(xué))中國科學(xué)技術(shù)部， 上海 201306；2. 水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點實驗室(上海海洋大學(xué))， 上海 201306；3. 水產(chǎn)科學(xué)國家級實驗教學(xué)示范中心(上海海洋大學(xué))， 上海 201306)

人體中包含26個鉀離子通道四聚體蛋白(potassium channel tetramerization domain, KCTD)，該家族成員均含有序列相似的鉀離子電壓門控(voltage-gated K+channels, Kv channels)的細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域[1-2]。KCTD蛋白在N端具有保守的BTB(Bric-a-brack,Tram-track, Broad complex, BTB)結(jié)構(gòu)域，也稱為POZ(poxvirus and zinc finger)結(jié)構(gòu)域，但是卻具有多變的C端。含有BTB結(jié)構(gòu)域的蛋白通過該結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)蛋白互作，其功能包括轉(zhuǎn)錄抑制、細胞骨架調(diào)節(jié)、離子通道的四聚體化、與泛素化連接酶E3(Cul3)相互作用等[3-7]。KCTD蛋白參與多種信號通路，包括Shh信號通路、Wnt/β-catenin信號通路和GABA信號通路等[2,8-15]。KCTD蛋白在增殖、分化、凋亡和新陳代謝等方面具有重要的調(diào)控作用，研究表明KCTD基因表達異常導(dǎo)致人類疾病的發(fā)生，如乳腺癌、髓母細胞瘤和肥胖等[2,6-19]，但該家族絕大多數(shù)成員的具體功能還不清楚。

CRISPR/Cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9, CRISPR/Cas9 )系統(tǒng)是繼鋅指核酸內(nèi)切酶(zinc finger endonuclease, ZFN)和類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶(transcription activator-like effector nuclease, TALEN)之后的第3代人工核酸內(nèi)切酶，可以實現(xiàn)特定基因的高效編輯[20-22]。

斑馬魚(Daniorerio)具有生殖周期短、胚胎透明和產(chǎn)卵量大等優(yōu)點，已成為研究器官發(fā)育以及疾病模型構(gòu)建等研究的模式生物[23]。KCTD1突變導(dǎo)致人類表皮-耳朵-乳頭綜合征(Scalp-ear-nipple syndrome, SEN)，其臨床表現(xiàn)包括頭皮表皮發(fā)育不全，沒有乳頭，耳朵畸形等[24]。本研究利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建斑馬魚kctd1基因突變體，并對kctd1在斑馬魚多個組織的表達水平進行定量分析，以期為進一步研究kctd1基因功能提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

野生型斑馬魚AB品系購自中國科學(xué)院生物化學(xué)與細胞生物學(xué)研究所，zCas9 質(zhì)粒由北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院張博教授實驗室惠贈，pUC19-scaffold 質(zhì)粒由北京大學(xué)分子醫(yī)學(xué)研究所熊敬維教授實驗室惠贈；DH5α 菌株購自天根生化科技(北京)有限公司；Cas9體外轉(zhuǎn)錄試劑盒mMESSAGE mMACHINETM?T7 Ultra Kit(AM1345)和gRNA體外轉(zhuǎn)錄試劑盒MAXIscript?T7inVitroTranscription Kit(AM1314)購自Ambion公司；DNA純化試劑盒DNA Clean & ConcentratorTM-5 (D4014)購自Zymo Research公司；Phusion?High-Fidelity PCR Master Mix(M0531L)和T7 Endonuclease I(M0302L)購自NEB公司；2×EasyTaq?PCR SuperMix for PAGE(AS112)購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；TRIzol(15596-018)購自Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (RR047A)購自Takara公司；LightCycler?480 SYBR Green I Master(Roche, 04887352001)和LightCycler?480II(Roche)實時熒光定量PCR系統(tǒng)均購自羅氏公司。

1.2 靶點及檢測引物的設(shè)計

在 Ensembl 網(wǎng)站(http://asia.ensembl.org/Danio_rerio/Info/Index)上查找目的基因序列，在zifit網(wǎng)站(http://zifit.partners.org/ZiFiT/)上設(shè)計一段20 bp大小的靶序列，在網(wǎng)站http://asia.ensembl.org/Danio_rerio/Tools/Blast?db=core上對靶序列進行BLAST比對，驗證靶點特異性。gRNA 體外轉(zhuǎn)錄模板的上游引物如下： 5′-TAATACGACTCACTATAGCAGCCTGGCCACATTAACCGTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3′；下游引物如下：5′-AAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCAC-3′。

在斑馬魚kctd1多個轉(zhuǎn)錄本共有區(qū)域即基因的第3個外顯子上設(shè)計靶點(圖1)。

注：紅色堿基代表Cas9蛋白識別的PAM(protospacer adjacent motif)位點

圖1靶點設(shè)計示意圖

Figure 1 Diagram of target site design

本實驗采用T7E1核酸內(nèi)切酶酶切檢測的方法進行突變體的篩選。該酶能夠識別并切割不完全配對的DNA Holliday 結(jié)構(gòu)或交叉DNA等。設(shè)計的引物需要符合以下原則：上下游引物距離靶位點兩側(cè)距離都大于 100 bp，兩個引物到靶點的距離差至少大于50 bp，PCR擴增產(chǎn)物大小范圍在300 bp至500 bp之間，且條帶單一。通過NCBI網(wǎng)站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)設(shè)計合適的引物，并由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，表1為所列引物序列信息。

表1 靶點及檢測用的引物序列信息

1.3 gRNA和Cas9 mRNA合成

gRNA合成。合成模板的準備：高保真酶PCR反應(yīng)體系包括12.5 μL Phusion?High-Fidelity PCR Master Mix，9.5 μL RNase-free H2O，1.0 μL(50 ng/μL)gRNA 質(zhì)粒， 1.0 μL上游引物，1.0 μL下游引物。反應(yīng)程序：98 ℃ 預(yù)變性30 s；98 ℃ 變性10 s，65 ℃ 退火15 s，72 ℃ 延伸50 s，共34個循環(huán)；72 ℃ 再延伸5 min。gRNA體外轉(zhuǎn)錄：按照試劑盒步驟進行RNA合成。

Cas9 mRNA合成。合成模板準備：X-baⅠ酶切體系包括1.0 μL Restriction Enzyme，1.0 μg Cas9 plasimid，5.0 μL 10×NEB Buffer，X μL RNase free H2O，反應(yīng)總體積50.0 μL。反應(yīng)程序是37 ℃ 20 min。Cas9 mRNA體外轉(zhuǎn)錄：按照試劑盒步驟進行RNA合成。

1.4 顯微注射及敲除檢測

在斑馬魚胚胎一細胞期進行注射，注射體系為Cas9 mRNA∶gRNA=400 ng/μL∶100 ng/μL，注射劑量V=1 nL。注射完成后，將胚胎置于28.5 ℃培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，并定期換水。

取注射后2 dpf的胚胎(5枚/管，3管)，向每管樣品中加入50 μL 50 mmol/L NaOH，95 ℃ 加熱10 min，振蕩；重復(fù)加熱振蕩；加入5 μL pH 8.0 1 mol/L Tris-HCl，10 000 r/min，離心5 min，上清即為基因組。根據(jù)表1所列引物進行PCR擴增反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系包括2.0 μL DNA模板，1.0 μL上游引物，1.0 μL下游引物，8.5 μL ddH2O，12.5 μL 2×EasyTaq?PCR SuperMix for PAGE。PCR反應(yīng)程序：94 ℃ 預(yù)變性3 min；94 ℃ 變性30 s，59 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸40 s，共34個循環(huán);72 ℃ 再延伸5 min。將PCR產(chǎn)物進行T7E1酶切檢測，將酶切成功的PCR產(chǎn)物送生工測序，若敲除成功，靶點附近及以后出現(xiàn)套峰。

1.5 F0斑馬魚生殖細胞對突變的遺傳性檢測

將敲除成功的F0胚胎飼養(yǎng)至性成熟，與顯微注射時留作對照的野生型成魚外交，收集發(fā)育2 dpf的胚胎(5枚/管，3管)，提取基因組后PCR擴增，T7E1酶切及測序檢測靶位點突變情況，將 T7E1 酶切成功的PCR產(chǎn)物進行測序，并將有突變對應(yīng)的F1胚胎養(yǎng)起來。

1.6 F1成年斑馬魚基因型鑒定

對54尾F1成年斑馬魚剪尾提取基因組，通過T7E1酶切及測序檢測，將酶切成功的PCR產(chǎn)物純化后進行TA克隆，每條F1挑選PCR產(chǎn)物的5個TA單克隆進行測序確定突變類型。

1.7 F2純合突變體的篩選

將獲得的兩種突變類型為+7 bp和-8 bp的F1雜合體成魚分別內(nèi)交，分別得到41尾和72尾F2。對F2成魚剪尾提取基因組，PCR產(chǎn)物進行T7E1酶切檢測，PCR產(chǎn)物切開對應(yīng)的個體為雜合子；未切開對應(yīng)的個體為WT或純合子，通過PCR產(chǎn)物測序及序列比對，確定F2基因型。

1.8 qRT-PCR檢測kctd1組織表達情況

用TRIzol法提取WT成魚的心臟、肝臟、皮膚、腦和鰓5個組織的總RNA，每個組織3個生物學(xué)重復(fù)。使用試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser進行RNA反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。在NCBI網(wǎng)站設(shè)計kctd1 qRT-PCR引物(表2)，使用羅氏SYBR和羅氏LightCycler?480II 實時熒光定量PCR系統(tǒng)進行熒光定量檢測，使用2-ΔΔct法計算基因相對表達量，使用軟件Graphpad prism5繪制柱狀圖。

表2 qRT-PCR 引物序列

紅框代表PAM和靶序列，黑色箭頭代表Cas9切割位置

圖2kctd1注射敲除后T7E1酶切檢測和測序分析

Figure 2 T7E1 assay and sequencing analysis ofkctd1 knock-out after injection

2 結(jié)果與分析

2.1 F0顯微注射敲除檢測

經(jīng)過T7E1酶切檢測，根據(jù)公式100×{1-sqrt[1-(b+c)/(a+b+c)]}計算敲除效率，a為未切開條帶灰度值，b、c為切開條帶的灰度值[26]。得出kctd1顯微注射的敲除效率范圍是11.60%～37.41%，將酶切成功對應(yīng)的PCR產(chǎn)物進行測序，發(fā)現(xiàn)在靶點附近及以后出現(xiàn)亂峰，說明敲除成功(圖2)。

2.2 F1突變類型檢測

通過F1成魚剪尾及PCR產(chǎn)物TA克隆檢測，成功獲得kctd1兩種突變類型，為+7 bp和-8 bp(圖3)。

2.3 F2純合突變體的篩選

經(jīng)過序列比對，得到F2兩種突變類型的純合突變體-8 bp-/-18尾，+7 bp-/-11尾，F(xiàn)2具體基因型統(tǒng)計情況如表3所示。

紅框代表靶序列，紅色箭頭代表Cas9切割位置

圖3 F1突變類型檢測

2.4 kctd1組織表達檢測

TRIzol法提取WT成魚心臟、肝臟、皮膚、鰓和腦組織RNA，qRT-PCR檢測kctd1基因的組織表達情況。定量結(jié)果顯示，相較于心臟、肝臟、皮膚和鰓組織，kctd1在腦組織中顯著高表達(圖4)。

***表示P<0.001

圖4野生型斑馬魚中kctd1組織表達分析

Figure 4 Expression ofkctd1 in WT zebrafish

3 討論與結(jié)論

CRISPR/Cas9作為第3代人工核酸內(nèi)切酶，能夠?qū)崿F(xiàn)單基因以及多基因的敲除，與TALEN、ZFN相比操作更加簡便。斑馬魚基因組與人類基因組具有很高的相似性，已經(jīng)成為研究器官發(fā)育與疾病模型構(gòu)建的理想模型。這些都大大提高了我們利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建斑馬魚kctd1基因突變體的可行性[20-23]。

KCTD家族在進化上具有保守性。有研究報道，KCTD1能夠與細胞朊蛋白(cellular prion protein，PrPC)相互作用，而且能夠抑制AP2α的轉(zhuǎn)錄活性[28-29]。人類中，KCTD1基因的突變則會導(dǎo)致頭皮-耳朵-乳頭綜合征，與TFAP2A異常導(dǎo)致的觸裂眼面綜合征(Branchio-oculo-facial syndrome, BOFS)具有相似的臨床表型，表明SEN和BOFS的發(fā)病機制可能具有相似性[24, 30]。人類KCTD1基因在乳腺、腎、腦和卵巢中表達，亞細胞定位顯示KCTD1屬于核蛋白[19]。我們的定量分析結(jié)果顯示，斑馬魚kctd1基因在野生型成魚腦組織中顯著高表達，對進一步研究kctd1基因功能有一定的參考價值。Kumar等用ENU構(gòu)建了小鼠Kctd1突變體，即Kctd1I27N，雜合突變體表現(xiàn)出腎功能衰竭，純合突變體在圍產(chǎn)期死亡[27]。我們用CRISPR/Cas9技術(shù)成功構(gòu)建了斑馬魚kctd1純和突變體，但是尚未發(fā)現(xiàn)明顯的表型，一方面可能是該基因在魚類和人類中功能有所差別，另一方面可能是因為斑馬魚中kctd基因家族其它成員基因補償效應(yīng)造成的，需要進一步研究。

目前，關(guān)于斑馬魚kctd基因突變體方面的研究很少。Tong等研究報道發(fā)現(xiàn)一尾斑馬魚kctd10的自發(fā)突變體，并利用TALEN技術(shù)重新構(gòu)建了斑馬魚kctd10突變體，研究結(jié)果表明，Kctd10通過抑制Tbx5a轉(zhuǎn)錄活性調(diào)控斑馬魚心臟的形態(tài)發(fā)生[31]。本研究利用CRISPR/Cas9技術(shù)成功構(gòu)建了斑馬魚kctd1基因突變體，顯微注射后檢測突變效率為11.60%～37.41%，最終篩選獲得可穩(wěn)定遺傳的插入缺失純和突變體(+7 bp-/-和-8 bp-/-)。斑馬魚kctd1基因突變體的構(gòu)建，為進一步研究kctd1基因功能提供了基礎(chǔ)；同時，斑馬魚研究結(jié)果將對人類KCTD1基因功能以及KCTD1致病機制的研究具有參考價值。