微生物發酵劑對四川風羊腿產品特性的影響

王 衛， 何 丹， 張佳敏， 趙志平， 白 婷， 吉莉莉， 陳 林(成都大學 肉類加工四川省重點實驗室， 四川 成都 610106)

0 引 言

風羊腿是我國傳統特色腌臘肉制品，產品以羊后腿為原料，經修整、上鹽、腌制、自然風干、貯藏成熟等工序制作而成，加工及貯藏期因不同地區在數周至數月[1].研究表明，風羊腿屬于aw值為0.70～0.80的典型半干水分食品(IMF)，具有極佳的非制冷可貯藏性[2].其特有風味的形成，主要取決于風干進程中以理化為主導，微生物參與的脂肪和蛋白質分解、氧化等反應，逐漸產生醛、酮、酸等一系列小分子化合物[3].借鑒西式微生物發酵劑干預技術，通過添加微生物發酵劑提升風味和品質，縮短發酵期，實現過程安全可控等，已成為傳統腌臘制品目前研究的熱點[4-5].

前期研究結果證實，添加微生物發酵劑的產品，其含水量、aw和pH值變化幅度顯然更大，發酵進程更快，發酵微生物呈現出極為顯著的抑制脂肪氧化和降低硝鹽殘留作用[6-8].以此為基礎，本研究重點對四川風羊腿中的總氮(TN)、非蛋白氮(NPN)、游離氨基酸和風味物含量進行測定分析，以進一步探究發酵劑對產品風味等特性的影響.

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材 料.

實驗所用材料包括：羊腿，由四川北牧南江黃羊集團有限公司提供；直投式凍干菌，由德國Chr. Hansen公司提供，菌種組合為肉色葡萄球菌、木糖葡萄球菌、戊糖片球菌和漢遜德巴利酵母菌.

1.1.2 儀 器.

實驗所用儀器包括：TJA-3130N型電子天平(上海民橋精密科學儀器有限公司)；ZFD-A5140型鼓風干燥箱(上海智城分析儀器制造有限公司)；HP-6890/5973型氣相色譜/質譜聯用儀(美國安捷倫科技有限公司)；LRH-250型生化培養箱(上海一恒科學儀器有限公司).

1.2 風羊腿制作

1.2.1 產品配方及實驗組設置.

以羊后腿為原料，每1 000 g肉料添加食鹽70 g、亞硝酸鈉0.1 g、D-異抗壞血酸鈉0.8 g、葡萄糖5.0 g、八角2 g、花椒4 g.設置不添加發酵菌的傳統自然風干A組和添加直投式凍干菌的B組.

1.2.2 制作工藝及主要技術參數.

風羊腿的制作工藝及主要技術參數為：修整→上鹽→入缸腌制(4 ℃，10 d，其間上下翻動3～4次)→清洗晾掛→修割整形→發酵風干(8～12 ℃，相對濕度50%～65%，26 d，至失重30%～32%)→切段、真空包裝→貯藏(6～8 ℃，15 d)→成品.

1.3 產品指標檢測

1.3.1 檢測指標及方法.

分別對風羊腿的原料(RM)，腌制后(AP)，發酵風干的第2～26 d(FD2至FD26)，以及包裝貯藏后成品(PS)按照如下方法進行指標測定：

1)TN含量參照國家標準GB5009.5-2016進行測定.

2)NPN含量測定.樣品自然解凍后，剔除可見脂肪和筋膜，絞碎，稱取4 g，加入0.05 mol/L的檸檬酸緩沖溶液(pH值為6.0)20mL，在冰浴中用組織搗碎機搗碎3次(22 000 r/min，每次10 s，間隔10 s)，于4 ℃下放置2 h后，于4 ℃下10 000 r/min離心15 min，快速濾紙過濾，在濾液中加入10%三氯乙酸(TCA)20 mL混合均勻，于4 ℃下放置過夜，然后2 500 r/min離心10 min，過濾后收集濾液，按半微量凱氏定氮法測定樣品NPN含量.

3)游離氨基酸含量測定.將樣品與去離子水按1∶2混合，勻漿后50 ℃水浴40 min，然后在4 ℃下8 000 r/min離心30 min.取750 μL上清液，加入300 μL(2 moL/L)KHCO3，用異硫氰酸苯酯(PITC)衍生1 h，取出后加入600 μL 1 moL/L HCl終止反應，冷卻，高速離心12 000 r/min，10 min.取上清液進樣測定.

在色譜分析時，色譜柱為Agilent C18柱，洗脫速度0.8 mL/min，進樣體積20 μL，檢測波長254 nm，柱溫(40±1)℃；流動相A為600 mL乙腈和400 mL超純水混合，經用0.22 μm水系濾膜過濾，脫氣備用；流動相B為11.48 g乙酸鈉，0.5 mL三乙胺(TEA)溶解于1 L超純水中，用1%醋酸調節pH值為6.4，混合均勻后，用0.22 μm水系濾膜過濾.同時，將復合氨基酸標準溶液用0.01mol/L HCl稀釋成不同濃度梯度.

4)揮發性風味成分測定.揮發性風味成分參照文獻[6]的方法進行測定，并稍作修改，具體步驟為：在風羊腿中段深入表皮1 cm下取樣，將肉樣剪碎后，準確稱取3.0 g粉碎均勻的樣品，放入15 mL頂空瓶中密封，采用動態頂空制樣.GC-MS分析圖譜經計算機和人工把每個峰同時與NIST library和Wiley Library相匹配檢索定性，匹配度和純度大于800(最大值1 000)作為定性分析結果.對化合物進行定量分析時，對總離子流量色譜圖用峰面積歸一化法定量，得出各組分的相對含量.

固相微萃取條件的為：固相微萃取頭CAR/PDMS 75 μm(美國SUPELCO 公司)，萃取溫度80 ℃，萃取時間40 min，解吸時間3 min.

儀器條件為：色譜柱為HP-INNOWAX(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，進樣口溫度250 ℃，分流比2∶1.升溫程序為起始溫度50 ℃，保持3 min，以每分鐘5 ℃速率升至150 ℃，再以每分鐘10 ℃速率升至260 ℃.離子源EI，電離能量70 EV，離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃，質量掃描范圍20～450 amu.

1.3.2 統計分析.

用Origin 7.5作圖，并用SPSS 18.0對數據進行統計分析.

2 實驗結果及分析

2.1 加工進程中TN和NPN變化

風羊腿加工進程中TN和NPN變化見圖1和圖2.

圖1 加工進程中TN含量變化曲線

圖2 加工進程中NPN含量變化曲線

由圖1和圖2可知，羊腿肉TN初始含量為9.24%，腌制期結束時稍降低，在風干發酵進行中逐漸有所上升，風干發酵結束時未添加微生物發酵劑的A組TN值和NPN值分別為11.06%和0.24%，真空包裝貯藏15 d后為11.57%和0.26%.風干發酵結束時添加微生物發酵劑的B組TN值和NPN值分別為11.06%和0.26%，真空包裝貯藏15 d后為11.57%和0.24%.TN值在包裝貯藏期有較顯著提升，NPN值變化不大，視乎呈現后發酵現象.兩組比較，添加發酵劑組變化幅度稍大，但兩組差異不顯著.

2.2 加工進程中游離氨基酸變化

風羊腿加工進程中游離氨基酸變化見表1和表2，總游離氨基酸變化見圖3.表1、2中，RM為原料，AP為腌制后制品，FD為發酵風干時間(天)，PS為包裝貯藏后成品.

圖3 加工進程中總游離氨基酸變化曲線

結果顯示，游離氨基酸量均隨羊肉火腿加工進程有不同程度的增加.未添加微生物發酵劑的A組，原料肉中游離氨基酸總量為635.69 mg /100 g，產品中游離氨基酸總量為3 115.08 mg /100 g，增加了4.9倍.添加微生物發酵劑的B組原料肉中游離氨基酸總量為636.82 mg/100 g，產品中游離氨基酸總量為5 211.18 mg/100 g，增加了8.2倍.添加微生物發酵劑呈現極為顯著的加速蛋白質分解，促進游離氨基酸的形成.

未添加微生物發酵劑的A組，游離氨基酸增加最多的是苯丙氨酸(Phe)、谷氨酸(Glu)、組氨酸(His)、異亮氨酸(Ile)和亮氨酸(Leu)，其次是精氨酸(Arg)、纈氨酸(Val)、丙氨酸(Ala)和天冬氨酸(Asp)等，胱氨酸(Cys)則降低較多.添加微生物發酵劑的B組，游離氨基酸增加最多的是谷氨酸(Glu)、組氨酸(His)、纈氨酸(Val)、苯丙氨酸(Phe)、亮氨酸(Leu)，其次是異亮氨酸(Ile)、天冬氨酸(Asp)、精氨酸(Arg)、賴氨酸(Lys)和丙氨酸(Ala)等，胱氨酸(Cys)稍有下降.

表1 風羊腿(A組)游離氨基酸測定結果表/(mg/100 g)

表2 風羊腿(B組)游離氨基酸測定結果表/(mg/100 g)

2.3 產品揮發性風味成分分析

本研究采用GC-MS分析法對兩組羊腿產品中揮發性風味物質進行測定，結果見圖4和表3.

圖4 風羊腿揮發性風味成分總離子流圖

由圖4和表3可知，就風味物相對含量上比較，A組含量最高的為醇類和酸類，其次分別為醛類、酮類、烯烴類和酚類，酯類物質未檢出；B組含量最高的為醇類和醛類.而從生成的風味物種類分析，A組依次為：酸類(8種)>醇類(5種)>醛類(4種)>烯烴類(3種)=酚類(3種)>酮類(2種)>酯類(0種)；B組中依次為：醛類(13種)>醇類(8種)=酸類(8種)>酯類(5種)>酮類(3種)>烯烴類(2種)=酚類(2種).A組共檢出25種，B組共檢出41種，添加微生物發酵劑的B組顯然更多，表明微生物發酵劑對風羊腿風味物質形成發揮了促進作用，這與Wang等[7-8]在微生物發酵劑對四川臘腸和臘肉風味影響的研究中的結果相符.

對產品中各類風味成分進行分類分析比較發現，醇類物質在未添加微生物發酵劑的A組中檢測到5種，在添加微生物發酵劑的B組中檢測到8種，兩組中均檢測到的物質為乙醇、正戊醇、沉香醇、α-松油醇和苯甲醇，添加了微生物發酵劑的B組產品α-松油醇和苯甲醇含量較A組有所提升，此外，1-己醇、2-辛烯-1-醇和正辛醇也比A組更加豐富；醛是肉香味的主要成分，未添加微生物發酵劑的A組產品中檢測出了4種醛類化合物，其中主要為壬醛，添加微生物發醇劑的B組產品中檢測出了13種醛類化合物，與未添加微生物發酵劑的A組相比，醛類化合物的種類和含量均得到提升， 說明微生物對提升醛類化合物含量具有較強的促進作用；酸類物質在兩組產品中均檢測出8種，主要為乙酸，但添加微生物發酵劑的B組乙酸含量與未添加微生物發酵劑的A組相比大大降低；酯類物質在未添加微生物發酵劑的A組中未檢出，在添加微生物發酵劑的B組中檢出5種，以辛酸乙酯和癸酸乙酯為主，具有果香和酒香香氣，對風味有促進作用.對比可見，添加了微生物發酵劑的B組產品酸類物質有所降低，而酯類物質含量得到提升，烯烴類化合物及酚類化合物兩組產品之間差異不大.

表3 風羊腿揮發性風味物質比較

3 結 論

本研究在四川風羊腿加工中，以傳統工藝為基礎，選擇商業化直投式微生物發酵劑，進行了腌制、風干發酵、包裝貯藏等制作工序，并對不同階段產品TN、NPN、游離氨基酸和風味物含量進行了分析.結果顯示：加工進程中TN和NPN在包裝貯藏期有較顯著提升，但添加與未添加發酵劑的產品差別不顯著.游離氨基酸量均隨羊肉火腿加工進程有不同程度的增加，未添加微生物發酵劑的產品增加了4.9倍，添加微生物發酵劑產品增加了8.2倍，添加微生物發酵劑呈現極為顯著的加速蛋白質分解，促進游離氨基酸的形成；風味物種類和含量檢測結果中，添加微生物發酵劑的產品，風羊腿的風味物種類達到41種，而未添加微生物發酵劑的產品僅為25種，尤其是在醇類、醛類及酯類物質的種類和含量上，添加微生物發酵劑的產品均更為豐富，其中，醇類物質增加了3種，醛類物質增加了9種，酯類物質檢測出5種，而未添加發酵劑的產品未檢出酯類物質.出現上述結果的影響成因和機制有待進一步深入探究.