高效液相色譜法測定酚酞片中的7個雜質

聶忠莉， 趙樹敏， 王曉玲， 趙玉玲， 張 勇， 蕭茂玲(.成都大學 藥學與生物工程學院， 四川 成都 6006； .成都克萊蒙醫藥科技有限公司， 四川 成都 6004)

0 引 言

酚酞片主要成分是酚酞[1]，臨床上常用于治療習慣性頑固性便秘.酚酞為刺激性傾瀉性，主要作用于大腸，口服后在腸道堿性環境中形成可溶性鈉鹽，刺激腸壁內神經叢，直接作用于腸道平滑肌，使腸蠕動增加.同時酚酞又抑制腸道內水分的吸收，使水和電解質在結腸蓄積，產生緩瀉作用，其作用與腸中堿性大小有關，且其作用溫和，很少引起腸道痙攣[2].

酚酞的制作主要由鄰苯二甲酸酐和苯酚反應合成.相關研究表明，酚酞在合成過程中，未完全反應的起始原料、反應的中間體、反應副產物和分解產物以及參與反應的試劑可能引入雜質A、雜質B、雜質C、雜質D、雜質E、雜質F、雜質G、雜質H、雜質I及雜質J 10種雜質，分別為鄰苯二甲酸酐、苯酚、熒光母素、2-羥基蒽醌、2-(4-羥基苯甲酰)苯甲酸、1-羥基蒽醌、酚酞啉、鄰苯二甲酸、芴和苯酞[3].《中國藥典》2015年版二部[4]收載酚酞片的雜質檢查項是采用薄層色譜法控制熒光母素的限度[5-6].本實驗是采用高效液相色譜法對酚酞片中可能存在的7個已知雜質(包括雜質A、雜質C、雜質D、雜質E、雜質F、雜質G及雜質I)含量進行控制研究，結果表明該方法具有合理性和有效性.

1 材料與儀器

1.1 材 料

實驗所用材料包括：鄰苯二甲酸酐(雜質A)(批號，906637-LJC0Q81，含量為99.79%)、芴(雜質I)(批號，334723-L8809，含量為98%)，購自北京百靈威科技有限公司；熒光母素(雜質C)(批號，100075-201303,含量為100%)，購自中國食品藥品檢定研究院；2-(4-羥基苯甲酰)苯甲酸(雜質E)(批號，FCC17197，含量為98.97%)、1-羥基蒽醌(雜質F)(批號，FCB044533，含量為95%)，購自英國Fluorochem公司；2-羥基蒽醌(雜質D)(批號，IBQBD-FAH1012,含量為97.4%)、酚酞啉(雜質G)(批號，18095-LVSKC-CB,含量為99.1%)，購自東京化成工業株式會社；酚酞片(批號，20170904、170802、180501、180502、180503，規格為50 mg/0.1 g)，購自四川省通園制藥有限公司；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水.

1.2 儀 器

實驗所用儀器包括：1410高效液相色譜儀(日立(中國)有限公司)，BP-210D型精密電子天平(賽多利斯科學儀器(北京)有限公司，756CRT型紫外分光光度計(上海佑科儀器儀表有限公司)，Kelisonic超聲清洗儀(深圳市科力超聲波洗凈設備有限公司).

2 方法與結果

2.1 溶液的配制

2.1.1 各雜質貯備液的制備.

精密稱取雜質A、雜質C、雜質D、雜質E、雜質F、雜質G及雜質I對照品適量，于100 mL容量瓶中加乙腈溶解并稀釋至刻度，制成1 mL中含各雜質0.5 mg的乙腈溶液，作為各雜質貯備液.

2.1.2 定位溶液.

取各雜質貯備液200 μL加乙腈稀釋至1 mL作為定位溶液.

2.2 色譜條件

實驗的色譜條件為：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以0.01 mol/L磷酸氫二甲溶液的0.1%醋酸水溶液—乙腈(90∶10)為流動相A，0.01mol/L磷酸氫二甲溶液的0.1%醋酸水溶液—乙腈(30∶70)為流動相B，進行梯度洗脫，洗脫條件[7]見表1；檢測波長為270 nm，柱溫40 ℃，流速1.0 mL/min.

表1 洗脫條件表

2.3 系統適用性

精密稱取酚酞片(批號，20170904)細粉約11.23 mg，置10 mL的量瓶中，再另取“2.1”項下雜質A、雜質C、雜質D、雜質E、雜質F、雜質G及雜質I貯備液各40 μL同置上述10 mL量瓶中，加乙腈至刻度，搖勻，即為系統適用性溶液.精密量取20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖如圖1所示.

圖1 系統適用性實驗色譜圖

由圖1可知，雜質E、雜質A、雜質G、酚酞、雜質D、雜質F、雜質C及雜質I依次出峰，主峰及各雜質峰保留時間的RSD均小于1.0%，峰面積的RSD小于2.0%，雜質峰之間的分離度均遠大于1.5，拖尾因子也在較好范圍內，表明本方法系統適用性好，可進一步進行研究.

2.4 酚酞片提取條件的選擇

精密稱取酚酞片(批號，170802)細粉約15 mg，共3份，分別置于10 mL量瓶中，加乙腈適量，分別超聲處理1、2、5 min，放冷后定容.各取2 mL離心(轉速為10 000 r/min)10 min，得上清液，另取2 mL用0.45 μm有機濾膜過濾，得續濾液，精密量取上清液、續濾液各20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖.結果表明，6種提取方法的結果基本一致，故任選一種作為酚酞片提取處理的方法，即超聲處理1 min后，再離心(轉速為10 000 r/min)10 min，得上清液，作為本片測定的供試品溶液.

2.5 定量限、檢測限

取“2.1”項下各雜質貯備液，分別加乙腈稀釋至系列濃度的供試品溶液，按照“2.2”項下的色譜條件，分別精密量取20 μL進行測定，計算當各雜質響應值約為基線噪音的3倍和10倍時的進樣量，結果計算出，雜質A、雜質C、雜質D、雜質E、雜質F、雜質G及雜質I的定量限分別為25.194 ng、9.881 ng、0.721 ng、6.899 ng、3.863 ng、11.989 ng、5.433 ng；檢測限分別為8.755 ng、2.430 ng、0.201 ng、3.265 ng、1.157 ng、3.965 ng、2.979 ng.

取相當于定量限濃度的供試品溶液，連續進樣6次，考察其重現性.結果表明，各峰保留時間RSD值均小于0.1%，峰面積RSD值均小于5.0%，表明重現性較好.

2.6 專屬性

取酚酞片細粉(批號，170802)，分別進行高溫、氧化、酸、堿及光照破壞實驗，考察各雜質的降解情況.結果表明，空白溶劑無干擾；破壞產生的雜質與主峰，以及雜質與雜質之間分離度均在1.5以上，能達到完全分離，主峰峰純度均達到0.999，雜質峰峰純度基本均達0.99以上；各破壞樣品的物料平衡均在98%～117%之間.實驗表明，該方法專屬性良好，能檢測出本品在儲藏和運輸過程的極端條件下產生的降解產物.

2.7 線性關系

取“2.1”項下各雜質貯備液用乙腈逐級稀釋得到系列雜質溶液，考察其濃度與峰面積的線性關系.結果表明，在1 μg/mL～23 μg/mL的濃度范圍內，各雜質峰面積與樣品濃度呈良好的線性關系，相關系數均達到0.999.

2.8 回收率

分別精密稱取酚酞片(批號，170802)細粉約15 mg，共10份，其中1份置10 mL量瓶中，加乙腈適量，超聲1 min，用乙腈稀釋至刻度，搖勻，離心(轉速為10 000 r/min)10 min后，得上清液，作為供試品空白溶液.另9份分別分成3組，分別加入“2.1”項下各雜質貯備液20 μL、40 μL、60 μL，每組3份，加乙腈適量，超聲1 min，用乙腈稀釋至刻度，搖勻，離心(轉速為10 000 r/min)10 min后，得上清液，分別作為回收率50%、100%、150%的供試品溶液.分別精密量取20 μL，注入液相色譜儀.另精密量取“2.1”項下各雜質貯備液0.8 mL于200 mL容量瓶中，加乙腈至刻度稀釋成1 mL中含各雜質2 μg的溶液，作為對照品溶液，同法測定.計算供試品溶液中各雜質的含量，并扣除酚酞中各雜質的含量，計算回收率.結果表明，雜質A、雜質C、雜質D、雜質E、雜質F、雜質G及雜質I 7個雜質的平均回收率分別為101.94%、103.02%、101.63%、100.87%、100.98%、99.11%、101.67%，RSD值分別為1.47%、2.31%、1.76%、1.06%、1.15%、0.74%、1.38%，表明了在該條件下，各雜質的回收率良好，準確度高.

2.9 重復性

精密稱取酚酞片(批號，170802)細粉6份，每份約15 mg，置10 mL量瓶中，分別精密加入“2.1”項下各雜質貯備液40 μL，加乙腈適量，超聲1 min，用乙腈稀釋至刻度，搖勻，離心(轉速為10 000 r/min)10 min后，得上清液，作為供試品溶液.分別精密量取20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖.另精密量取“2.1”項下各雜質貯備液0.8 mL，加乙腈稀釋成1 mL中含各雜質2 μg的溶液，作為對照品溶液，同法測定.計算6份樣品中各雜質的含量，并計算RSD.結果表明，雜質A、雜質C、雜質D、雜質E、雜質F、雜質G及雜質I 7個雜質的RSD值分別為3.81%、1.57%、1.38%、1.57%、1.96%、1.51%、3.81%，表明本方法的重復性好.

2.10 中間精密度

由不同分析人員在不同時間，采用不同儀器對同一批樣品的6份供試品溶液進行測定.結果表明，雜質A、雜質C、雜質D、雜質E、雜質F、雜質G及雜質I 7個雜質的RSD值分別為4.16%、4.90%、4.95%、1.75%、1.84%、4.78%、3.85%，表明中間精密度良好.

2.11 穩定性

以回收率項下的100%-1#溶液，作為供試品溶液.分別在0、13、17、36 h注入液相色譜儀，記錄不同時刻樣品中各雜質的峰面積，并計算RSD.結果表明，雜質A、雜質C、雜質D、雜質E、雜質F、雜質G及雜質I 7個雜質的RSD值分別為0.76%、1.29%、1.13%、1.03%、1.32%、2.32%、1.30%，表明了在36 h內溶液的穩定性良好.

2.12 耐用性

精密稱取酚酞片(批號，170802)細粉約15 mg，置10 mL量瓶中，分別精密加入“2.1”項下各雜質貯備液40 μL，加乙腈適量，超聲1 min，用乙腈稀釋至刻度，搖勻，離心(轉速為10 000 r/min)10 min后，得上清液，作為供試品溶液.量取“2.1”項下各雜質貯備液40 μL，用乙腈溶解稀釋至10 mL作為對照品溶液.分別精密量取上述溶液各20 μL，在柱溫、流速、色譜柱及檢測波長等進行微小變動的條件下，進樣測定，記錄色譜圖，按外標法計算各雜質的含量，并計算RSD.結果表明，雜質A、雜質C、雜質D、雜質E、雜質F、雜質G及雜質I 7個雜質的RSD值分別為4.21%、4.90%、4.81%、2.90%、2.72%、4.83%、3.87%，表明本方法耐用性良好.

2.13 樣品測定

取酚酞片細粉約15 mg，精密稱定，置10 mL量瓶中，加乙腈適量，超聲1 min，用乙腈稀釋至刻度，搖勻，離心(轉速為10 000 r/min)10 min后，得上清液，作為供試品溶液.另取各雜質雜質A、雜質C、雜質D、雜質E、雜質F、雜質G及雜質I適量，加乙腈制成1 mL各含雜質2 μg混合溶液作為對照品溶液.分別精密量取上述各溶液20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖.供試品溶液色譜圖中如有與對照品溶液色譜圖中雜質峰保留時間一致的峰，按外標法計算各雜質的含量，含各雜質應不得過0.1%.各批樣品檢測結果見表2.

表2 各批樣品檢測結果

由表2可知，2個規格共6批樣品均只檢出有關雜質C,且雜質C的含量均小于0.1%，均未檢出其他有關雜質和未知雜質，因此2個規格共6批樣品結果符合規定.

3 討 論

本研究采用可見—紫外分光光度計，在200～400 nm波長范圍內掃描，對各雜質的吸收波長進行了考察.結果表明，雜質A、雜質B、雜質C、雜質D、雜質E、雜質F、雜質G、雜質H、雜質I及雜質J在220 nm、250 nm、270 nm波長處均有吸收，綜合各雜質看，每個雜質在270 nm波長處有最大吸收，所以將各雜質的測定波長擬定在270 nm波長處.

由于雜質D、雜質F及雜質I在各批樣品中均未檢出，在穩定性考察過程中也未見增加趨勢，所以僅作研究，未收載入質量標準.雜質C在各批樣品中均可檢出，雜質A、雜質E及雜質G在堿破壞條件下均有產生，所以將雜質A、雜質C、雜質E和雜質G收載入質量標準，限度為不得過0.1%.

本研究通過對雜質A、雜質C、雜質D、雜質E、雜質F、雜質G及雜質I測定方法進行了方法學研究，其專屬性、定位試驗、系統適用性、定量限、檢測限、回收率、重復性、中間精密度、穩定性及耐用性均達到良好的效果，表明所采用的分析方法是科學的、合理的，并能有效控制酚酞片中各雜質的含量.《中國藥典》2015年版二部收載的酚酞片質量標準中，僅對熒光母素(雜質C)的含量進行限度控制，采用的是薄層色譜法，而本研究中采用高效液相色譜法對雜質A、雜質C、雜質D、雜質E、雜質F、雜質G及雜質I進行含量控制，該測定方法優于現行藥典中給出的相關檢測方法.