應用Time-lapse優選胚胎觀察胚胎發育速度對單胚胎移植妊娠結局的影響

陳磊，季悅，王珊珊，姜偉華，王沛青

(南京大學醫學院附屬鼓樓醫院生殖醫學中心，南京 210008)

隨著輔助生殖技術的飛速發展，多胎妊娠率也逐年增高，從而導致母嬰并發癥也越來越多[1-2]。單胚胎移植作為降低多胎妊娠的有效手段之一，得到人們越來越多的重視。相對于雙胚胎移植而言，要保證較好的妊娠結局，單胚胎移植對移植胚胎的質量要求更高。目前移植胚胎的選擇依據仍然主要是形態學觀察指標，卵裂球數目能夠有效的反映胚胎的發育速度，可以預測胚胎活力與妊娠結局。根據Istanbul共識，Day 2卵裂球數目為4細胞，Day 3卵裂球數目為8細胞的胚胎具有較高的著床能力[3]。同時Magli等[4]研究指出，Day 3的8細胞階段的胚胎是理想的移植胚胎。然而，臨床上有較多患者會獲得發育較快的Day 3受精胚胎(>8細胞)，這類胚胎移植的妊娠結局狀況鮮有研究報道。

本研究將應用時差成像系統(Time-Lapse imaging，TLI)培養技術，基于卵裂模式與時間參數分層篩選模型優選胚胎進行移植，回顧性分析了胚胎發育速度單因素對單胎妊娠結局的影響，探討具有較快卵裂率的胚胎的發育潛力和應用前景。

資料與方法

一、研究對象

對2014年4月至2017年5月在南京鼓樓醫院生殖中心行常規體外受精(IVF)單分裂胚移植的患者資料進行回顧性分析?；颊呒{入標準：(1)因盆腔輸卵管因素行IVF助孕；(2)常規IVF周期；(3)獲卵數為5～15枚；(4)月經第3日FSH<12 U/L；(5)女方年齡<40歲；(6)周期數<2個；(7)常規促排卵方案[5]。排除標準：(1)PGS/PGD周期；(2)供卵周期；(3)男性因素不育；(4)移植日內膜<8 mm。

根據第3天移植胚胎的卵裂球數目分為8～9細胞組(n=168)、10～11細胞組(n=36)、12～16細胞組(n=30)，且10～11細胞組、12～16細胞組中均無符合優質胚胎篩選條件的8～9細胞胚胎。

二、研究方法

1.TLI系統：本研究所采用的時差成像系統是Primo Vision TLI(Vitrolife，瑞典)[6]，它是將培養箱與胚胎倒置顯微鏡相結合，通過數據線將胚胎發育過程中所采集到的圖片傳輸到培養箱外的顯示器上，拍照頻率為5 min/次，能夠有效地監測胚胎發育的整個過程。此培養系統有自己專用的集合培養皿(WOW)，WOW是一種9孔培養皿，每個孔都有自己獨立的數字編號，便于胚胎學家區分。

2.配子的采集與胚胎培養：采用常規促排卵方案，B超監測卵泡生長，待主導卵泡直徑達到18～20 mm后注射HCG(珠海麗珠制藥)，36 h后行陰道B超引導下卵泡穿刺取卵術。獲卵3 h后，采用短時受精法，將采集到的人卵母細胞與精子按1∶10 000的比例混合加入IVF(Vitrolife，瑞典)微滴中，共同孵育5 h后機械剝除顆粒細胞，通過觀察第二極體是否釋放來判斷受精情況，之后將受精卵轉移至含有G1(Vitrolife，瑞典)培養液的WOW集合培養皿中，置于Primo Vision TLI系統培養觀察到第3 d進行移植。

3.胚胎評估：根據Istanbul共識對分裂期胚胎質量進行評分。以授精時間為起點，通過時差成像系統記錄胚胎發育過程中的卵裂模式與時間參數，采用本中心建立的胚胎篩選模型進行胚胎篩選[7]。移植胚胎篩選范圍是：卵裂模式為正常、不均或非軸性卵裂，且時間參數符合s2<0.50 h (s2=t4-t3，即停留在3細胞階段時間)、t5<48.93 h (5細胞分裂時間)。如該患者無符合上述篩選條件的胚胎，則不納入本研究范圍。

4.移植與妊娠結局判定：單胚胎移植周期中，在TLI系統中培養到第3天，優先移植符合篩選條件的8細胞胚胎，若無則選取符合篩選條件的卵裂速度較快的胚胎(≥9個細胞)移植后常規黃體支持，2周后檢測血HCG 當血HCG>5 U/L，4～6周B超檢查見孕囊及胎心為臨床妊娠。

三、統計學分析

結果

一、根據移植胚胎發育速度分組的患者一般臨床資料與結局

8～9細胞組、10～11細胞組和12～16細胞組3組患者的年齡、體重指數(BMI)、獲卵數、基礎FSH、基礎LH、內膜厚度等均無顯著差異(P>0.05)；3組間種植率、流產率、活產率亦無顯著差異(P>0.05)(表1)。

二、根據移植胚胎的卵裂球數目奇偶數分組的患者一般臨床資料與結局

奇數組和偶數組兩組患者的年齡、BMI、獲卵數、基礎FSH、基礎LH、內膜厚度等均無顯著差異(P>0.05)。兩組臨床結局比較，偶數組的種植率、活產率均顯著高于奇數組 (P<0.05)。偶數組的流產率低于奇數組，但差異無統計學意義(P>0.05)(表2)。

表1 不同胚胎發育速度患者基本信息與臨床結局[(-±s)，%]

表2 卵裂球奇偶數患者基本信息與臨床結局[(-±s)，%]

注：與偶數組比較，*P<0.05

三、根據偶數卵裂球胚胎發育速度分組的患者一般臨床資料與結局

將卵裂球數目為偶數的胚胎按照胚胎發育速度分為8細胞組、10細胞組和12～16細胞組進行分析，3組患者的年齡、BMI、獲卵數、FSH、LH、內膜厚度等均無顯著差異(P>0.05)，3組間種植率、流產率、活產率亦無顯著差異(P>0.05)(表3)。

表3 不同發育速度的偶數卵裂球胚胎患者基本信息與臨床結局[(-±s)，%]

討論

單胚胎移植技術中胚胎選擇是關鍵，靜態學評估是目前大多數生殖中心常用的評價胚胎移植前活力的方式[8]。根據ESHERE發布的2011版Istanbul共識，在受精后(68±1)h觀察胚胎，綜合比較其卵裂球大小、數目、胞質碎片、空泡等靜態學參數，從而挑選出最優質胚胎進行移植。但形態學指標并不能準確地反映出胚胎發育的實際情況，其卵裂方式是否異常，卵裂是否同步均無法體現。近年來興起的時差成像技術通過連續攝像能夠有效克服這些弊端，Pribenszky等[9]研究證明，與普通培養箱經靜態形態學參數評估相比，通過Time-lapse培養，運用形態動力學參數挑選胚胎可顯著提高妊娠率及活產率。本中心前期研究證明，相對于傳統的靜態形態學評估，TLI挑選優質胚胎行Day 3單胚胎移植的臨床妊娠率可提高27%[10]。本研究所基于的時間參數是s2<0.5 h和發育至5細胞時間(t5)<48.93 h，有相關研究報道，在此時間參數范圍內挑選的胚胎能夠有效提高患者的懷孕幾率，并減少多胎妊娠的發生[7]。

由于患者卵子與精子自身的原因，以及培養環境和操作損傷等影響，絕大部分受精卵并不能發育成優質的8細胞胚胎。較多胚胎發育速度較快，移植當日已經達到10細胞，有些甚至達到14細胞。在傳統的靜態形態學觀察下，在有形態較好的8細胞胚胎的情況下，10細胞及以上的胚胎一般不用于移植，將會繼續培養觀察。通過TLI，我們發現有許多胚胎于Day 3發育成8細胞，并且形態比較完美，但是卵裂過程可能存在許多異常事件,例如異常卵裂、卵裂球多核等[11]。Wong等[12]研究表明，兩個形態相同的胚胎可能會經歷完全不同的發育過程。本研究通過TLI系統對胚胎發育進行動態觀察，探究患者在無符合時間參數且卵裂球數目為8的優質可移植胚胎的情況下，挑選滿足時間參數且卵裂球數目大于8的胚胎移植，其臨床結果是否存在差異。結果顯示，在種植率方面，8～9細胞為61.90%，10～11細胞為53.80%，12～16細胞為53.33%，并不存在統計學差異(P>0.05)。而洪焱等[13]研究發現，大于8細胞的單胚胎著床率要低于8細胞胚胎，但其樣本量較少，可能是導致本研究結果與其不一致的原因。Chimote等[14]研究認為，在發育速度較快的胚胎中約有70%左右的染色體異常者在囊胚形成過程中被淘汰，從而導致了囊胚的質量相對提高，有著更好的發育潛能，這一現象在一定程度上解釋了本研究中移植卵裂球數目較多的胚胎，患者的流產率并沒有明顯提高，而Alikani等[15]通過對受精后第3天不同發育速度胚胎的囊胚形成比較發現，細胞數為7～9的胚胎其囊胚形成率明顯高于細胞數>10的胚胎。

以往的研究早已證實，胚胎的卵裂球發育速度與染色體狀況有關[16]。在靜態學評分系統下，受精后Day 3，卵裂球數目大于10的胚胎經常存在由于卵裂球排列緊密導致將碎片等胞質結構誤認為卵裂球的現象。在細胞數較多的情況下，卵裂球和碎片的區別很難用肉眼去區分，尤其是在含有大碎片以及一些卵裂球嚴重不均的胚胎中更是如此[17]。靜態評分為10細胞乃至12細胞，很可能包含了 1至2個大碎片，這些細胞質碎片是從受精胚胎或早期胚胎排出的膜包裹的細胞質結構，含DNA的可能性非常低。同時Alikani等[15]發現含有大碎片的胚胎與含有較小、分散碎片的胚胎相比，其種植率明顯降低。胚胎的發育是一個動態過程，人為選擇胚胎觀察的特定時間點，根據形態參數和當前的發育狀況選擇胚胎，本身就存在一定的局限性，在發育過程常發生的非二倍性卵裂方式，會導致在靜態學觀察下細胞發育過快。這都有可能是部分研究顯示大于10細胞的胚胎發育潛能低于7～9細胞的原因，而TLI技術通過實時監測系統可以有效避免這一問題。

本研究結果顯示，卵裂球數目為奇數的胚胎其種植率與活產率要顯著低于卵裂球數目為偶數的胚胎。這可能是由于卵裂球數目為偶數的胚胎染色體正常比例要高于奇數胚胎，與劉見橋等[18]研究結果相符。為避免卵裂球奇偶數對卵裂速度分組的影響，本研究將三組中卵裂球為奇數的胚胎去除后，分別對8細胞組，10細胞組，12～16細胞組進行分析，結果顯示，三組種植率、流產率、活產率均無顯著差異(P>0.05)，與不分卵裂球奇偶數的結果一致，表明本研究分組的結果不受卵裂球奇偶數的影響。

綜上所述，TLI技術是一種新興的胚胎監測手段，能夠更加有效的幫助胚胎學家選擇優質胚胎進行移植。在本項研究中我們發現在同樣符合時間參數與卵裂模式的條件下，相對于8細胞而言，移植10細胞及以上的胚胎其種植率、流產率、活產率等方面并沒有顯著差異。在臨床助孕治療過程中，對于未獲得發育速度正常且符合時間參數的胚胎的患者而言，移植符合時間參數但是發育相對較快的胚胎仍然可以獲得較好的臨床結局。此研究不足之處在于移植10細胞以上和卵裂球數為奇數的胚胎樣本量相對較少，在今后的研究中，我們將不斷擴大樣本量予以考證。