精子DNA碎片指數與IVF/ICSI結局的相關性

黃文思，葉麗君，宋明哲，朱元昌，孫青，李觀貴，曾勇*

(1.深圳中山泌尿外科醫院生殖醫學中心，深圳 518045；2.深圳中山生殖與遺傳研究所，深圳 518045；3.深圳市圍著床期生殖免疫重點實驗室，深圳 518045)

目前，臨床上常用常規精液分析的參數(包括精子濃度、總數、活動力與形態學等)來評估男性生育力。但是部分男性不育是由精子DNA損傷引起的[1]，常規精液分析參數異常的不育男性的精子DNA損傷通常增多，也有部分常規精液參數正常的不育男性的精子DNA損傷也較多，而常規精液分析不包括精子DNA損傷的檢測[1]，因此常規精液分析的參數對臨床診斷男性不育及男性生育力評估的價值存在局限性。近年來，DNA碎片指數(DFI)作為評估精子DNA損傷的重要指標被廣泛研究，并且越來越多的研究指出DFI比常規精液分析參數對男性不育診斷和生育力評估有更好的價值[2-4]。有報道指出，精子DNA損傷與自然受孕、宮腔內人工授精(IUI)[5]和IVF低的妊娠率有關[6-7]，并與IVF/ICSI妊娠丟失的高風險存在相關性[6-8]。但是，也有報道指出DFI與輔助生殖技術(ART)妊娠結局無相關性[9-10]。可見DFI與ART治療結局的相關性仍然存在爭議。本文旨在分析DFI與IVF/ICSI治療結局的關系，探討精子DNA損傷對IVF/ICSI結局的影響。

材料與方法

一、研究對象

回顧性分析2017年1～12月因不孕不育前來深圳中山泌尿外科醫院生殖中心就診的夫婦，男方在男科實驗室同期進行精液常規檢查和DFI檢測，這些夫婦后續根據ART治療指征選擇IVF或ICSI治療。IVF治療的指征為男方精液檢查未見異常，因女方因素不育的夫婦。ICSI治療的指征為男方精子濃度<2×106/ml；或者精子濃度2×106/ml～20×106/ml，活動精子百分率<40%或前向運動精子<25%；或者精子濃度≥20×106/ml，活動精子百分率<5%；或者正常形態前向運動精子總數≤1×106/ml的不育夫婦。

入選標準：夫婦雙方無性傳播疾病史、無遺傳性疾病；來院治療的第一周期，并為新鮮胚胎移植周期。

排除標準：男方排除精子濃度<2×106/ml、無精子癥等因素(因DFI檢測對于精子數量的需求)；女方排除輸卵管積水、子宮內膜異位癥、子宮肌瘤等因素。

共有311對夫婦符合上述標準，其中134對夫婦行常規IVF治療，177對夫婦行ICSI治療。

二、方法

1.精液參數分析：取卵日前3個月內，參照《世界衛生組織人類精液檢查與處理實驗室手冊》第5版(WHO5th)的標準采集和處理精液標本。利用電子天平(深圳衡之寶)稱量精液質量，計算精液體積。采用Makler計數池(Sefi-Makler，以色列)載樣放于相差顯微鏡(尼康，日本)，通過計算機輔助精液分析操作系統(CASA系統，Microptic，西班牙)計算精子濃度、各級精子百分率和活動精子百分率，前向運動精子為主動地呈直線或沿一大圓周運動的精子，非前向運動精子為所有其他非前向運動的精子。使用Diff-Quik染色液(深圳華康生物)進行精子染色，在光學顯微鏡下人工分析精子形態學。精液常規參數的正常范圍分別為：體積≥1.5 ml，精子濃度≥15×106/ml，前向運動精子百分率≥32%，活動精子百分率≥40%，正常形態精子百分率≥4%。

2.精子染色質結構分析法(SCSA)法測定DFI值：運用基于流式細胞術的SCSA法測定DFI值，使用精子核完整性染色試劑盒(浙江星博生物)進行檢測，按照試劑盒說明書方法操作。經吖啶橙染色后上流式細胞儀(BD Accuri C6，美國)檢測熒光，計算DFI(%)=綠色熒光精子數/(綠色熒光精子數+紅色熒光精子數)×100%。根據DFI參考值將IVF和ICSI周期的患者分別分為DFI≤30%組和DFI>30%組[11-13]。

3.精液處理：男方禁欲2～7 d，在取卵日通過手淫法取精，精液在室溫下液化后，采用密度梯度離心法處理精液，再置于37℃、5%CO2培養箱中培養備用。

4.控制性促排卵和卵母細胞收集：本中心采用標準方案、常規長方案、短方案和超長方案促排卵。當優勢卵泡直徑≥18 mm時，注射HCG，34～36 h后行陰道B超穿刺取卵，卵細胞置于37℃、5%CO2培養箱中培養備用。

5.治療方式：(1)IVF治療：卵母細胞培養3～5 h后授精，每個卵母細胞加入5～10萬個精子。受精后16～18 h去除卵丘細胞，觀察受精情況，出現2個原核為正常受精。觀察受精后胚胎的卵裂及發育情況。(2)ICSI治療：取卵后4～6 h進行卵胞漿內單精子注射。受精72 h后，根據本中心實際情況制定的胚胎評分系統將胚胎分級，然后選擇1～2個優質胚胎移植。

6.觀察指標、妊娠結局判斷：MⅡ卵率=(MⅡ卵母細胞數目/獲卵總數目)×100%；MⅡ卵受精率=(受精卵數目/MⅡ卵母細胞數目)×100%；卵裂率=(受精卵裂數目/受精卵數目)×100%；優胚率=(優質胚胎數目/受精卵裂數目)×100%；臨床妊娠率=(臨床妊娠周期數/移植周期數)×100%；流產率=(流產例數/臨床妊娠例數)×100%。胚胎移植14 d后驗血HCG，呈陽性為生化妊娠。移植5周后B超檢查見子宮腔內有妊娠囊及原始搏動，即確定為臨床妊娠。

三、統計學分析

采用SPSS 23.0軟件進行統計分析。呈正態分布的計量數據以(均數±標準差)表示，兩組間比較用獨立樣本t檢驗，采用皮爾遜相關性分析方法分析相關性；呈非正態分布的計量數據[表示方式為中位數(四分位距)]，則采用非參數Mann-Whitney U檢驗進行分析，采用斯皮爾曼相關性分析方法分析相關性。計數數據組間比較采用皮爾遜χ2檢驗分析。P<0.05為差異有統計學意義。

結果

一、研究對象的基本情況

本研究共分析134個IVF鮮胚移植周期，其中DFI≤30%組100個周期、DFI>30%組34個周期，和177個ICSI鮮胚移植周期，其中DFI≤30%組100個周期、DFI>30%組77個周期。IVF周期與ICSI周期中，DFI≤30%組的DFI、男方年齡均顯著低于DFI>30%組(P<0.05)，而組間不育年限、女方年齡、女方BMI、獲卵數均無統計學差異(P>0.05)(表1)。

二、DFI與精液參數的相關性

在IVF與ICSI周期，男方DFI>30%組的前向運動精子百分率和活動精子百分率均顯著低于DFI≤30%組(P<0.05)，而組間的精液體積差異無統計學意義(P>0.05)。另外，在ICSI周期，DFI>30%組的精子濃度、前向運動精子百分率均顯著低于DFI≤30%組(P<0.05)；但在IVF周期，DFI>30%組與DFI≤30%組間的其他精液參數(包括精子濃度、非前向運動精子百分率與正常形態精子百分率)差異均無統計學意義(P>0.05)(表2)。

在IVF與ICSI周期，DFI與前向運動精子百分率、活動精子百分率均呈中度負相關。在ICSI周期，DFI還與精子濃度、非前向運動精子百分率、正常形態精子百分率呈極弱負相關(表3)。

表1 不同DFI組的患者基本情況及各項觀察指標的比較 (-±s)

注：與DFI≤30%組比較，*P<0.05

表2 不同DFI水平的各項精液參數的比較 [中位數(四分位距)]

注：與DFI≤30%組比較，*P<0.05，#P<0.001

表3 DFI與各精液參數的相關性分析

注：|r|<0.3，極弱相關；0.3<|r|<0.5，低度相關；0.5<|r|<0.8，中度相關；|r|>0.8，高度相關。與DFI的相關性分析，*P<0.05，#P<0.001

三、DFI與IVF/ICSI治療結局的關系

在IVF周期，DFI>30%組的受精率、卵裂率均顯著低于DFI≤30%組(P<0.05)，但兩組的優胚率差異無統計學意義(P>0.05)。在ICSI周期，DFI>30%組的優胚率顯著低于DFI≤30% 組(P<0.05)，而兩組的胚胎發育情況包括受精率、卵裂率差異均無統計學意義(P>0.05)。另外，無論行IVF治療還是行ICSI治療，不同DFI水平的臨床妊娠率差異無統計學意義(P>0.05)；DFI>30%組的流產率高于DFI≤30%組，但差異無統計學意義(P>0.05)(表4)。

在IVF周期，DFI與受精率、卵裂率均呈極弱負相關(P<0.05)。但是，在ICSI周期，DFI與受精率、卵裂率、優胚率均沒有相關性(P>0.05)(表5)。

表4 不同DFI水平的IVF和ICSI結局各項觀察指標的比較(%)

注：與DFI≤30%組比較，*P<0.05；a：早期流產；b：晚期流產；a+b：早期流產和晚期流產

表5 DFI與IVF和ICSI治療結局各指標的相關性分析

注：|r|<0.3，極弱相關；0.3<|r|<0.5，低度相關；0.5<|r|<0.8，中度相關；|r|>0.8，高度相關。與DFI的相關性分析，*P<0.05

討論

近年越來越多研究關注精子DNA損傷，一方面是由于特發性不育男性中精子DNA斷裂發生率高；另一方面是由于DNA斷裂的精子被用于輔助生殖受精可能帶來潛在的不良結局。

本研究顯示DFI>30%組的男方年齡顯著高于DFI≤30%組，但精子DFI與年齡相關性較弱。Vagnini等[14]的研究結果也表明隨著年齡的增加精子DFI有所增加，但臨床意義有限。Singh等[15]對此現象的解釋是隨著年齡的增長，清除凋亡精子的機制減退，不能有效清除DNA受損的精子，可能是DFI升高的原因之一。隨著年齡的增加，男性生殖功能逐漸減退，Belloc等[16]研究發現男方年齡也是影響臨床妊娠率的重要因素，臨床妊娠率隨男方年齡的增加而下降，從<35歲時的14.4%下降至>45歲時的9.3%(P<0.01)。本研究組發現男方年齡與IVF周期的受精率、卵裂率、臨床妊娠率呈極低到低度的負相關(r分別為-0.371、-0.377和-0.227，P<0.05)，與ICSI周期的優胚率呈低度負相關(r=-0.321，P<0.05)(數據未顯示)。這提示男方年齡可能影響IVF/ICSI的治療結局，在一定程度上對DFI與IVF/ICSI的治療結局相關性分析造成影響。

精子DNA損傷與精液質量相關[1，4，17]；而有的報道則指出精子DNA損傷與精液參數無相關性[18]。本研究發現，無論IVF周期還是ICSI周期，DFI>30%組的前向運動精子百分率均顯著低于DFI≤30%組，且DFI與前向運動精子百分率呈中度負相關。另外，在ICSI周期DFI>30%組的精子濃度、非前向運動精子百分率與正常形態精子百分率均顯著低于DFI≤30%組，且DFI與這些精液參數呈極弱到低度的負相關。這說明精子DNA損傷與精液質量存在相關性，尤其是前向運動精子百分率。劉作強等[19]發現IVF的受精率、優胚率與精液常規參數無相關性，但優胚率與DFI呈負相關，建議臨床中應重視精子功能檢查，以獲得更好的治療結局。本研究組也發現精液參數包括精子濃度、前向運動精子百分率、活動精子百分率和正常形態精子百分率等與IVF的受精率、卵裂率以及ICSI的優胚率無相關性(P>0.05)(數據未顯示)，然而DFI與IVF的受精率、卵裂率均呈極弱負相關(P<0.05)。結果表明，DFI可作為評估精子功能的一項指標，也是精液常規分析參數的有效補充，對其的檢查有益于臨床評估男性生育力。

不少研究報道精子DNA損傷對胚胎發育和臨床妊娠情況的影響，有研究指出精子DNA損傷在IVF與ICSI周期對優胚率和臨床妊娠率存在負面影響[6，13，20]。國內的一篇Meta分析也顯示，在IVF周期，高DFI降低IVF的受精率、優胚率和臨床妊娠率，增加IVF和ICSI的流產率，但對ICSI的受精率、優胚率和臨床妊娠率無影響[21]，建議高DFI患者選擇ICSI治療[21-22]。有學者則認為DFI與IVF和ICSI結局沒有相關性，Sun等[12]研究了238個IVF周期和152個ICSI周期，在IVF或ICSI周期DFI>30%組與DFI≤30%組的受精率、優胚率和臨床妊娠率的差異無統計學意義(P>0.05)，提出DFI不能預測行ART治療患者的受精率、胚胎質量和臨床妊娠率。存在這些爭議可能原因有：一是研究對象的入選標準不同，二是DFI檢測方法不同，三是卵母細胞對精子DNA損傷的修復能力不同等。

本研究比較IVF鮮胚移植的臨床結局發現，DFI>30%組IVF周期的受精率與卵裂率較DFI≤30%組降低，DFI與受精率、卵裂率均呈極弱的負相關，而不同DFI組的臨床妊娠率和流產率的差異無統計學意義(P>0.05)，這提示DFI可能影響早期胚胎發育，對IVF周期的臨床結局無明顯影響。比較ICSI鮮胚移植的臨床結局發現，DFI>30%組的優胚率較DFI≤30%組降低，這提示精子DNA損傷對胚胎的前期發育有負面影響。但是，DFI的增多沒有降低ICSI的臨床妊娠率，雖然ICSI的流產率增加，但差異無統計學意義(P>0.05)。由此可見，DFI在一定程度上可以預測IVF和ICSI的胚胎前期發育，但對IVF和ICSI臨床結局的預測價值有限，這可能與卵母細胞可以修復精子DNA損傷[23]有關。這可能提示在IVF周期中，精子DNA損傷可能導致受精率和卵裂率降低[24-26]；而ICSI治療能“繞過”精子DNA損傷給精子和卵母細胞受精時帶來的影響[27]，但無法準確地篩選到DNA完整的精子進行注射，因此DFI>30%組的優質胚胎率有可能降低；隨著后續卵母細胞對精子DNA損傷的修復作用，使胚胎發育正常，不同DFI組間臨床結局的差異縮小。

綜上所述， DFI檢測可作為常規精液分析的補充。另外，精子DNA損傷可能影響ART的早期胚胎發育，降低IVF周期的受精率與卵裂率，和ICSI周期的優胚率，提示精子DFI檢測對預測ART的早期胚胎發育有一定參考價值，但對ART的臨床妊娠結局的預測價值有限。