飼料酶中的主效酶與輔效酶

■馮定遠(yuǎn)

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，廣東廣州510642）

酶制劑應(yīng)用于動(dòng)物日糧的復(fù)雜性源于飼料原料的復(fù)雜性，飼料原料的復(fù)雜性主要體現(xiàn)在物理特性和化學(xué)特性兩方面。物理特性主要是不同成分的空間結(jié)構(gòu)與嵌合方式和程度等；化學(xué)特性主要是同一類成分的組成單位的差異與主鏈長(zhǎng)短及支鏈分布形式等。這種復(fù)雜性既表現(xiàn)在營(yíng)養(yǎng)成分之間（如蛋白質(zhì)、淀粉、脂肪間的嵌合），也表現(xiàn)在同一類營(yíng)養(yǎng)成分內(nèi)部（如蛋白質(zhì)中氨基酸的排列組合、淀粉中抗性淀粉的差異、脂肪中脂肪酸1、3 位點(diǎn)與2 位點(diǎn)的差別等），更表現(xiàn)在營(yíng)養(yǎng)成分與抗?fàn)I養(yǎng)成分的嵌合與影響，這決定了酶制劑在日糧中應(yīng)用不簡(jiǎn)單，單酶或者普通的復(fù)合酶往往受制于這些復(fù)雜性而不能很好地發(fā)揮作用，我們提出了組合酶、配合酶、組合型復(fù)合酶和組合型配合酶，就是針對(duì)這類飼料日糧常常出現(xiàn)的問(wèn)題。但是，這里還有一個(gè)問(wèn)題沒(méi)有解決，就是組合酶或者配合酶中，各種單酶之間的關(guān)系問(wèn)題。另外，不同來(lái)源酶的作用底物也存在差異性，如催化作用的位點(diǎn)和結(jié)合鍵合方式的不同的影響等。實(shí)際上。復(fù)雜的成分與多樣的酶相互作用存在一種主次關(guān)系、主從關(guān)系、主要與輔助關(guān)系。自然環(huán)境產(chǎn)生的酶，大部分是以一個(gè)酶系、整個(gè)酶族群存在，這種酶系或者酶群一般是有關(guān)聯(lián)的、有序的，之間的重要程度是有區(qū)別的。過(guò)去提出組合酶和配合酶并沒(méi)有討論到這些關(guān)系，更多是看作等同與平衡關(guān)系。其實(shí)，普通的復(fù)合酶作用同樣也存在哪個(gè)為主，哪個(gè)為輔的問(wèn)題。這也是為什么目前的復(fù)合酶配制五花八門(mén)，酶譜多樣的一個(gè)原因。所以，有必要探討各種單酶之間的關(guān)系，明確是哪個(gè)酶發(fā)揮更大作用，在復(fù)合酶、組合酶或者配合酶的研發(fā)中兼顧高效性與經(jīng)濟(jì)性。

1 飼料主效酶與輔效酶的依據(jù)

1.1 物料物理結(jié)構(gòu)的序列性

纖維素是由葡萄糖通過(guò)β-1, 4糖苷鍵鏈接而成的線狀結(jié)構(gòu)分子，具有簡(jiǎn)單的初級(jí)和復(fù)雜的三級(jí)結(jié)構(gòu)。纖維素鏈的聚合度（葡萄糖殘基數(shù)）從500到14 000不等（Marx-Figini等，1966）。植物細(xì)胞壁中，纖維素鏈的排列有序程度不同，在一些區(qū)域，纖維素鏈高度有序排列，在氫鍵作用下形成晶體；而其他區(qū)域則松散排列，纖維素分子形成非晶體狀。天然晶體纖維素的結(jié)構(gòu)為I 型，通過(guò)堿處理可以轉(zhuǎn)化成Ⅱ型結(jié)構(gòu)（Beguin 等，1994），這兩種類型的纖維素的區(qū)別在于鏈內(nèi)氫鍵間存在差異。此外，天然結(jié)晶纖維素可能由兩種結(jié)構(gòu)稍有差異的I型纖維素構(gòu)成，即Iα、Iβ，這兩種亞型的區(qū)別也在于其分子內(nèi)氫鍵間有差異（Atalla等，1984）。

纖維素中的晶體化部分僵硬，不易被內(nèi)切作用的纖維素酶降解，而非晶態(tài)的纖維素則易被稀酸、內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶降解（Sinitsyn 等，1990）。因此，完全降解纖維素需要采用濃酸或復(fù)合酶系，攻擊其結(jié)晶區(qū)和非結(jié)晶區(qū)。

使用高純度的內(nèi)切葡聚糖酶和來(lái)自嗜松青霉(P.pinophium)的CBHS的試驗(yàn)，只有二種內(nèi)切葡聚糖酶（EG Ⅲ和EGⅤ）對(duì)纖維素具有很強(qiáng)的吸附性，與CBHSⅠ和CBHSⅡ有協(xié)同作用（見(jiàn)圖1，Wood 等，1989）。作者認(rèn)為在CBHSⅠ和Ⅱ與內(nèi)切葡聚糖酶之間的協(xié)同作用，是因?yàn)檫@兩類酶間的不同立體空間結(jié)構(gòu)造成的。所以物理空間的不同，會(huì)造成酶水解的差異。有特異立體結(jié)構(gòu)的內(nèi)切葡聚糖酶催化纖維素主鏈，只可產(chǎn)生一到兩種非還原性殘基末端，后者可被有特異立體結(jié)構(gòu)的CBH水解。通過(guò)CBH連續(xù)水解纖維二糖的同時(shí)，將暴露另一個(gè)不同特異立體結(jié)構(gòu)的鏈端，會(huì)受到其他具有特異立體結(jié)構(gòu)的CBH催化分解。

圖1 來(lái)自嗜松青霉(P. pinophlum)的CBHS（Ⅰ和Ⅱ型）與內(nèi)切葡聚糖酶（EⅠ至EⅤ）之間在水解棉花纖維上的協(xié)同作用

在CBH和CBH（外切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶）之間的協(xié)同作用，主要是因?yàn)槠湎嗷閷?duì)方提供新的水解結(jié)合部位的能力，以及從還原端到非還原端的催化能力（Barr 等，1996）。大量的研究表明：在聚合的嗜熱纖維單胞菌（C. thermocellum）酶系中，酶復(fù)合體的組裝對(duì)于在結(jié)晶纖維素的溶解中亞基間的最大催化協(xié)同效應(yīng)是十分關(guān)鍵的（Bhat 等，2001)。看起來(lái)簡(jiǎn)單的棉花纖維素就如此復(fù)雜，飼料物料就更不用講了。從仿生角度，人工配制的酶制劑添加劑必須選擇不同酶進(jìn)行配合，才能達(dá)到高效水解的目的。

1.2 底物化學(xué)成分的差異性

木聚糖（Xylan）是植物細(xì)胞壁的重要組成成分，連接細(xì)胞壁中的木質(zhì)素和纖維素，是最主要的半纖維素，廣泛存在于硬木（15%～30%）、軟木（7%～10%）和草本類植物中（低于30%）。兩種主要的阿拉伯木聚糖是：①來(lái)源于種子胚乳的高度分支、且沒(méi)有糖醛酸取代基的阿拉伯木聚糖；②存于木質(zhì)化組織中的、有較少分支、有糖醛酸和/或4-氧-甲醚以及半乳糖取代基的阿拉伯木聚糖（Bhat等，2001）。木聚糖的主鏈由木糖經(jīng)β-1,4-糖苷鍵連接而成，而其支鏈結(jié)構(gòu)由于來(lái)源的不同而有所差異。

木聚糖具體分類有：①葡萄糖木聚糖（glucuronoxylans）；②阿拉伯糖木聚糖（arabinoxylans）；③葡萄糖阿拉伯糖木聚糖（glucuronoarabinoxylans），都是以五碳糖的木糖以β-1, 4 鍵連接形成聚糖作為主鏈骨架，側(cè)鏈上是葡萄糖、阿拉伯糖或者同時(shí)有葡萄糖和阿拉伯糖（Rogowski等，2015）。第一種的代表是樺木來(lái)源的木聚糖，第二種的代表是小麥來(lái)源木聚糖，第三種的代表是玉米來(lái)源木聚糖。玉米的木聚糖主要是葡萄糖、阿拉伯糖木聚糖，同時(shí)含有葡萄糖和阿拉伯糖，而且支鏈特別多，更復(fù)雜。所以，一般的木聚糖酶未必能夠發(fā)揮作用。谷物類飼料中（小麥、玉米、燕麥）木聚糖的存在形式主要為阿拉伯木聚糖（AX），即主要的支鏈結(jié)構(gòu)為阿拉伯糖取代基；而來(lái)源于硬木（樺木、櫸木等）的木聚糖的支鏈結(jié)構(gòu)則主要為乙酰基、葡萄糖醛酸等。阿拉伯糖主要在主鏈的C2 或C3位置進(jìn)行雙取代或單取代，而乙酰基主要在C3 位置進(jìn)行單取代（Kormelink 等，1993）。除這兩種側(cè)鏈取代基外，木聚糖的支鏈結(jié)構(gòu)還包含多種支鏈，如阿魏酸(ferulic acid)、葡萄糖醛酸(glucuronic acid)、香豆素（p-coumaric）等（Gruppen 等，1992）。木聚糖的側(cè)鏈取代基，包括阿拉伯糖和阿魏酸，能夠?qū)δ揪厶敲赴l(fā)揮空間阻力作用（Akin等，2008）。

1.3 天然存在的酶系與酶之間的協(xié)同作用

飼料酶制劑針對(duì)的底物包括三類：營(yíng)養(yǎng)性底物、抗?fàn)I養(yǎng)底物和功能成分前體物，在自然狀況下，都不同程度存在酶系協(xié)同作用的現(xiàn)象，例如，簡(jiǎn)單的脂肪水解，除了廣譜性的脂肪酶催化外，更多的是催化甘油1、3 位點(diǎn)與催化2 位點(diǎn)脂肪酸的脂肪酶協(xié)同完成。而飼料最復(fù)雜的成分是纖維部分，包括纖維素與半纖維素（有六碳糖和五碳糖，其中重要的是木聚糖），為了討論的方便，我們聚焦于催化纖維素和木聚糖的纖維素酶和木聚糖酶，兩種重要的非淀粉多糖酶。我們?cè)谶@里引用Bhat等（2001）的分析討論。

纖維素酶和木聚糖酶由細(xì)菌和真菌產(chǎn)生，如需氧性微生物（aerobes）、厭氧性微生物（anaerobes）、嗜溫微生物（mesophiles）、嗜熱微生物（thermophiles）和極溫微生物（extremophiles）。好氧性真菌和細(xì)菌通常產(chǎn)生細(xì)胞外的纖維素酶和半纖維素酶。

厭氧性細(xì)菌[熱纖維梭菌（Clostridium thermocellum）、嗜纖維梭菌（C. cellulovorans）、白色瘤胃球菌（Ruminococcus albus）、生黃瘤胃球菌（R. flavefaciens）、產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌（Fibrobacters succinogenes）、解纖維素醋弧菌（Acetivibrio celluolyticus）]和厭氧性真菌[（Neocallinmastix frontalis）、（N. patriciarum）、（Piromyces equi）]均以多酶復(fù)合體的形式產(chǎn)生纖維素酶（Groleau 等，1981；Lamed 等，1987；Wood，1992a；Gilbert等，1993；Beguin等，1996；Bhat等，1997）。

內(nèi)切葡聚糖酶能特異地作用于非晶態(tài)的、膨脹的、取代的纖維素和纖維木聚寡糖內(nèi)的β-1，4 糖苷鍵。這些內(nèi)切葡聚糖酶通常對(duì)結(jié)晶纖維素和纖維二糖不敏感，可攻擊大麥葡聚糖的β-1，3 鍵和β-1，4 鍵（Petre 等，1986）。纖維二糖水解酶對(duì)結(jié)晶纖維素和纖維寡糖的降解能力有限（Wood等，1988），但對(duì)非晶態(tài)的、膨脹的纖維素有較高活性。自然界中有兩種類型纖維二糖水解酶：優(yōu)先從還原端降解纖維素鏈和特異性地從非還原端釋放纖維二糖（Barr 等，1996；Teeri，1997）。

內(nèi)切木聚糖酶又可分為特異性和非特異性木聚糖酶（Coughlan，1992；Coughlan 等，1993）。特異性內(nèi)切木聚糖酶僅對(duì)木聚糖的β-1，4鍵有活性，而非特異性內(nèi)切木聚糖酶可以水解以β-1，4鍵連接的木聚糖、混合木聚糖的β-1，4鍵及其他β-1，4連接的多糖。

大多數(shù)內(nèi)切木聚糖能特異性地作用于木聚糖的非取代木糖苷鍵，并釋放取代的和非取代的木寡糖。相反，其他內(nèi)切木聚糖酶特異性作用于在主鏈上的接近取代基團(tuán)的木糖苷鍵。例如，來(lái)源于黑曲霉（Aspergillus niger）的兩種酶（PI 8.0 和9.6）對(duì)去掉阿拉伯糖取代基的木寡糖和木聚糖表現(xiàn)很小活性或沒(méi)有活性（Frederick等，1985）。

Giligan等（1954）在水解纖維素的過(guò)程中，首次證實(shí)了不同纖維素酶間的協(xié)同增效作用。Bhat等(2001)總結(jié)了真菌纖維素酶中存在五種協(xié)同作用：①內(nèi)切葡聚糖酶和一種稱為C1的非水解蛋白間的協(xié)同作用（Reese 等，1950）；②β-葡木糖酶和內(nèi)切葡聚糖酶或者CBH 之間的協(xié)同作用（Eriksson 等，1985）；③二個(gè)免疫學(xué)上相關(guān)的或截然不同的CBH 之間的協(xié)同作用（Wood等，1986）；④源自相同或不同微生物內(nèi)切葡聚糖酶和CBH之間的協(xié)同作用（Wood等，1989）；⑤二種內(nèi)切葡聚糖酶之間的協(xié)同作用（Klyosov，1990）。另外，細(xì)菌纖維素酶和真菌纖維素酶之間的協(xié)同作用，與來(lái)自嗜熱纖維素單胞菌（C. thermocellum）的多酶復(fù)合體的亞基之間的協(xié)同作用一樣（Bhat 等，1994；Wood 等，1994）。協(xié)同模式有：①內(nèi)切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶間（CBH）的協(xié)同作用；②外切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶之間的協(xié)同作用；③內(nèi)切葡聚糖酶和內(nèi)切葡聚糖酶之間的協(xié)同作用。

曲霉菌（Aspergillus）和隱酵母（Cryptococcus）也能產(chǎn)生木聚糖酶和木聚糖去側(cè)鏈酶（Coughlan 等，1993a，b；Viikari 等，1993）。厭氧微生物能產(chǎn)生降解木聚糖、甘露聚糖的復(fù)合多酶系統(tǒng)，這是厭氧微生物的特征（Beguin 等，1996；Hazlewood 等，1998b）。與纖維素類似，有效而徹底的分解木聚糖需要有不同特性的主鏈裂解酶和支鏈裂解酶的協(xié)同作用（Coughlan等，1993；Coughlan 等，1993）。分解木聚糖的酶協(xié)同作用模式也有三種類型：①同型協(xié)同；②異型協(xié)同；③抗協(xié)同（Coughlan等，1993）。同型與異型協(xié)同可能有一種或二種產(chǎn)物。同型協(xié)同可以是在二種或多種的側(cè)鏈裂解酶之間的協(xié)同，也可能是在二種或多種的主鏈裂解酶之間的協(xié)同（Coughlan等，1993）。

一個(gè)同型協(xié)同的例子是從米曲霉（A. oryzae）中提取阿魏酸酯酶和從膠囊青霉（P. capsulatum）中提取的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶之間的協(xié)同作用，通過(guò)后

者使得前者水解阿魏酸化的阿拉伯木聚糖，釋放阿拉伯糖變得容易（Coughlan等，1993）。異型協(xié)同作用是一種在支鏈和主鏈裂解酶間的相互協(xié)同作用（Coughlan等，1993）。如果主鏈裂解酶的作用使得支鏈裂解酶釋放的取代基更多，那么這種異型協(xié)同作用有唯一產(chǎn)物，反之亦然。如果通過(guò)復(fù)合酶的作用，取代基的釋放量和主鏈的水解程度，超過(guò)了單一酶制劑的添加作用，則此異型協(xié)同作用是個(gè)雙產(chǎn)物過(guò)程。

在阿魏酸酯酶和內(nèi)切葡聚糖酶之間（Faulds 等，1991；Tenkanen 等，1991）、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶與內(nèi)切葡聚糖酶之間（Tuohy等，1992），乙酰木聚糖酯酶和內(nèi)切葡聚糖酶之間（Biely 等，1986；Lee 等，1987），以及葡萄糖苷酸酶和內(nèi)切葡聚糖酶之間均有異型協(xié)同作用。

當(dāng)一種類型酶的作用阻礙另一種類型酶的作用時(shí)，就會(huì)出現(xiàn)抗協(xié)同作用（Coughlan 等，1993）。這在阿拉伯木聚糖水解酶（Fredeick 等，1985）或者與葡聚木聚糖葡聚糖水解酶（Nishitani 和Nevins，1991）的作用中已有表現(xiàn)，一種酶僅在附近有特殊取代基時(shí)，才能裂解主鏈。葡聚木聚糖葡萄糖苷酸水解酶取代基的存在是其對(duì)主鏈裂解所必需的，通過(guò)相關(guān)的側(cè)鏈裂解酶對(duì)取代基裂解后，葡聚木聚糖葡萄糖苷酸水解酶將不能裂解主鏈。

2 飼料主效酶及輔效酶的概念和意義

Bhat 等(2001)在專門(mén)討論“纖維素酶和木聚糖酶酶學(xué)及其他特征”的綜述時(shí)就總結(jié)指出：仍有一些問(wèn)題值得探討“纖維素酶和半纖維素酶形成多酶復(fù)合體和解聚合的相對(duì)效率；在水解復(fù)雜木質(zhì)纖維素底物過(guò)程中單一酶的作用”。從這兩位專家提到的“多酶復(fù)合體”中各種單酶存在相對(duì)效率，我們很自然就推導(dǎo)到相互之間有主次關(guān)系、從屬關(guān)系。最近Cozannet 等（2017）也研究了“多碳水化合物酶復(fù)合體，multi-carbohydrase complex，MCC”中木聚糖酶與阿拉伯呋喃糖苷酶的協(xié)同作用。

為了徹底水解復(fù)雜的物料，天然的微生物能夠產(chǎn)生一個(gè)相互配合、協(xié)同作用的酶系，一個(gè)相關(guān)聯(lián)的酶（族）群，或者稱為“多酶復(fù)合體”。過(guò)去我們討論的“組合酶”和“配合酶”就屬于多酶復(fù)合體，其中組合酶是針對(duì)同一類底物，例如多種纖維素酶的組合，配合酶是針對(duì)不同類底物，如纖維素酶與木聚糖酶的配合（馮定遠(yuǎn)等，2011）。在這種多酶復(fù)合體中，各種酶的關(guān)系，特別是平衡關(guān)系、主次關(guān)系、從屬關(guān)系如何？相對(duì)效率如何？是否可以量化等等？并沒(méi)有引起注意。

探討這個(gè)問(wèn)題，我們可以提出一個(gè)概念，就是主效酶與輔效酶，或者是基礎(chǔ)酶與附屬酶的關(guān)系。

所謂“主效酶”就是：在多酶復(fù)合體中，針對(duì)目標(biāo)底物起基本作用，發(fā)揮主導(dǎo)功能，主攻催化化學(xué)構(gòu)成中主鏈位點(diǎn)或者物理空間主體成分的單酶。相對(duì)應(yīng)，“輔效酶”是指在多酶復(fù)合體中，發(fā)揮輔助性，次要性甚至是依附性作用，在某些側(cè)鏈或者支鏈（一般比側(cè)鏈長(zhǎng)）起作用的單酶。

“主效酶”的另一個(gè)理解是單獨(dú)使用時(shí)，其達(dá)到目標(biāo)的效率比“輔效酶”更高。但是，主效酶與輔效酶配合作用，應(yīng)起到協(xié)同的效果，比各自單獨(dú)使用的效率更高。

實(shí)際上，“主效酶”與“輔效酶”是相對(duì)概念，在不同的催化水解目的中，是可以互換的。例如，在纖維素、半纖維素及其產(chǎn)物中，有時(shí)候是抗?fàn)I養(yǎng)因子，有時(shí)候是益生元的原料，簡(jiǎn)單理解，木聚糖酶對(duì)消除木聚糖的黏性是主效酶，α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶和阿魏酸酯酶等側(cè)鏈糖苷酶可能是輔效酶，相反，如果是產(chǎn)生益生元調(diào)節(jié)腸道菌群，情況可能不一樣。

“主效酶”和“輔效酶”可以體現(xiàn)于組合酶、配合酶這類關(guān)聯(lián)度緊密的酶之間關(guān)系中，廣義上理解，普通的復(fù)合酶也可能存在主效與輔效的關(guān)系，只是這種主次關(guān)系并沒(méi)有從屬關(guān)系。例如在含有蛋白酶和木聚糖酶等的復(fù)合酶中，針對(duì)小麥型日糧，木聚糖酶是主效酶，而蛋白酶可能是輔效酶，針對(duì)雜粕型日糧，蛋白酶往往扮演主效酶的角色，木聚糖酶則是輔效酶。

一般地，主效酶是一個(gè)單酶，輔效酶可以有多個(gè)不同的單酶。當(dāng)然，單一純合的底物不需要輔合酶。

與主效酶和輔效酶相關(guān)聯(lián)的一個(gè)容易辯識(shí)的概念是底物成分的主鏈和側(cè)鏈及相應(yīng)的主鏈酶和側(cè)鏈酶，嚴(yán)格上講，并沒(méi)有主鏈酶和側(cè)鏈酶的講法，這是一個(gè)通俗的稱謂。另外，是側(cè)鏈還是支鏈也沒(méi)有嚴(yán)格的區(qū)別，一般是支鏈更長(zhǎng)些，但比主鏈短，而側(cè)鏈的基本構(gòu)成單位更少。

主效酶用一個(gè)簡(jiǎn)單而直接的說(shuō)法，就是在設(shè)計(jì)配制特定的飼料酶制劑時(shí)，第一個(gè)想到的酶，或者重點(diǎn)考慮的酶，就是主效酶。主效酶和輔效酶并不僅僅存在于組合酶和配合酶，這些典型的“多酶復(fù)合體”這類關(guān)聯(lián)緊密的單酶之間。如果把日糧配方作為一個(gè)整體看，以動(dòng)物的生產(chǎn)性能作為判斷，復(fù)合酶中不同的單酶也存在主效酶與輔效酶之別。

在針對(duì)一個(gè)復(fù)雜原料或者有關(guān)聯(lián)的一組有機(jī)物成分進(jìn)行降解的天然存在的酶，往往是一個(gè)多種酶的集群，單一的酶作用不大。酶系或者“多酶復(fù)合體”應(yīng)是大自然的普遍情況，正如指出，需要探討其中單酶的相對(duì)效率問(wèn)題，我們?cè)诖嘶A(chǔ)上，提出“飼料主效酶與輔效酶”的理念。有一定的理論意義及實(shí)踐價(jià)值。

降解復(fù)雜木聚糖（AX）的主效酶是木聚糖酶，木聚糖酶也是最廣泛應(yīng)用的飼料添加劑中的酶制劑之一(馮定遠(yuǎn)，2013)。Paloheimo 等（2010）深入討論了以飼料添加劑形式的木聚糖酶。他認(rèn)為在飼料酶制劑市場(chǎng)中，植酸約占一半，其余基本是非淀粉多糖酶（NSP酶），而NSP 酶則最多的是木聚糖酶。木聚糖酶種類很多，黑曲酶（A.niger）和綠色木霉（T. viride）就可分別產(chǎn)生15種和13種木聚糖酶（Biely,1985）。酶蛋白的氨基酸序列和空間結(jié)構(gòu)的不同，決定了它們?cè)谒饽揪厶菚r(shí)的酶切位點(diǎn)存在差異性，因而根據(jù)水解糖苷鍵的不同，木聚糖酶可分為不同的糖苷水解酶家族（glycoside hydrolase family，GH），如GH5、GH7、GH8等(Coughlan 等，1993)。用作飼料添加劑的一般是糖苷水解酶家族的GH10 和GH11 的木聚糖酶（Paloheimo 等，2010）。常見(jiàn)的飼用Xyn屬于糖苷酶家族10（作用于主鏈上的≥2個(gè)木糖連接體）和糖苷酶家族11（作用于主鏈上的≥3 個(gè)木糖連接體），分解主鏈木聚糖上的木糖苷鍵，屬于內(nèi)切酶。植物中的木聚糖結(jié)構(gòu)，一般每10 個(gè)木糖單位中有8～9個(gè)帶有側(cè)鏈結(jié)構(gòu)，阻礙Xyn與主鏈結(jié)構(gòu)的接觸，使Xyn不能有效發(fā)揮作用，只有充分降解木聚糖的側(cè)鏈，Xyn的作用功效才會(huì)增加。

木聚糖（AX）的完全降解需要多種酶的協(xié)同作用才能完成(Collins等，2005)，主要包括內(nèi)切型木聚糖酶（endo-1,4-β-D-xylannase, EC 3.3.1.8）、木糖苷酶(β-D-xylosidases, EC 3.2.1.37)以及木聚糖支鏈分解酶（accessory enzymes），包括α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶（α-L-arabinofuranosidase, EC.3.2.1.55）、乙酰木聚糖酯酶（acetyxylan esterase, EC 3.1.1.72）、阿魏酸酯酶（ferulic acid esterase, EC 3.1.1-）等。而作為復(fù)雜木聚糖降解的輔效酶阿拉伯呋喃糖苷酶（Abf）和阿魏酸酯酶（FAE）則被了解不多。阿拉伯呋喃糖苷酶和阿魏酸酯酶分別可以特異性地降解AX支鏈的阿拉伯糖和阿魏酸酯鍵（Poutanen 等，1988），從而利于木聚糖酶對(duì)AX的降解作用（Akin等，2008）。AbfB能夠催化多聚糖、低聚糖和多糖非還原端α-連接的阿拉伯殘基的水解(陳芳芳,2018)，生成一個(gè)α-L-阿拉伯糖分子。當(dāng)AbfB 和Xyn共同作用于AX時(shí)，首先側(cè)鏈的阿拉伯糖快速被降解而釋放，然后Xyn才作用于主鏈木聚糖釋放木糖；阿拉伯糖的移除給Xyn 提供了作用位點(diǎn)，同時(shí)也增加了底物的溶解性。因此，AX的降解，首先要移除側(cè)鏈，然后再降解主鏈。研究表明，在半纖維素酶系中額外添加AbfB，可以明顯增加還原糖的生成量(Huang,2017)。而FAE能水解主鏈中的阿魏酸酯鍵，釋放出阿魏酸或阿魏酸二聚體(范韻敏,2012)。當(dāng)FAE 和Xyn 共同作用于AX 時(shí)，首先側(cè)鏈的阿魏酸酯鍵快速被FAE 破壞，為Xyn 提供了合適的作用位點(diǎn)，然后Xyn才作用于主鏈木聚糖釋放木糖。

添加阿拉伯呋喃糖苷酶和阿魏酸酯酶都可以顯著提高木聚糖酶降解AX的協(xié)同因子（degree of synergistic value），促進(jìn)AX的降解，生成更多的還原糖（Lei等，2016）。阿拉伯呋喃糖苷酶（McCleary等，2015）和阿魏酸酯酶（Wong 等，2013）同木聚糖酶的協(xié)同作用分別在谷物副產(chǎn)物上也得到了證實(shí)。此外，先采用支鏈降解酶去除AX的支鏈結(jié)構(gòu)，再用木聚糖酶降解AX的 效 果 會(huì) 更 好（Raweesri 等，2008；Sorensen 等，2007）。阿拉伯呋喃糖苷酶和阿魏酸酯酶的同時(shí)添加，能夠較單獨(dú)添加兩種支鏈酶，進(jìn)一步提高木聚糖的降解作用（Lei等，2016）。

飼料主效酶與輔效酶提出的意義有多個(gè)方面：一是深化對(duì)單酶催化作用的研究，也利于深入了解酶作用的機(jī)理，酶發(fā)揮作用位點(diǎn)，障礙酶催化的影響因素等；二是探討酶之間的協(xié)同性、抗協(xié)同性及其生化基礎(chǔ)；三是確定主效酶是酶制劑添加劑的基礎(chǔ)，主效酶往往可以以單酶形式作為飼料添加劑，例如：植酸酶、木聚糖酶、蛋白酶常常是以單酶形式在日糧中添加。四是在日糧結(jié)構(gòu)改變并更復(fù)雜的情況下，飼料酶制劑酶譜設(shè)計(jì)需要相適應(yīng)，在確定主效酶的情況下，再增加不同的輔效酶；五是確定了主效酶與輔效酶以及有多少個(gè)輔效酶后，在配制飼料酶酶譜，或者選擇飼料酶產(chǎn)品時(shí)，可以根據(jù)成本因素，靈活多樣，也就是所謂的產(chǎn)品的“性價(jià)比”更有依據(jù)；六是復(fù)雜的飼料原料與多酶復(fù)合體的關(guān)系研究，在確定了主效酶與更多個(gè)輔效酶的關(guān)系后，更有利于開(kāi)發(fā)新的飼料資源。

3 飼料酶制劑中主效酶與輔效酶的含義與應(yīng)用實(shí)踐（見(jiàn)圖2）

圖2 復(fù)雜木聚糖的主鏈與側(cè)鏈及相應(yīng)酶作用位點(diǎn)

上面已討論了自然條件下，纖維素酶和木聚糖酶的復(fù)雜性，一般是以酶系或者“多酶復(fù)合體”形式存在而徹底水解纖維類物料。如果在配制的飼料酶中，模擬“多酶復(fù)合體”而選擇主效酶與輔效酶最好的模型就是帶有側(cè)鏈或者支鏈的木聚糖。在谷麥類飼料原料中，木聚糖的主要存在形式為阿拉伯木聚糖（AX）。AX 以β-1,4-糖苷鍵連接而成的D-吡喃木糖為主鏈骨架，在α-1,2 和α-1,3 位由α-L-阿拉伯呋喃糖以側(cè)鏈的形式進(jìn)行單取代或雙取代，在阿拉伯呋喃糖的O-5位通常會(huì)有阿魏酸形成酯鍵。完全降解AX需要木聚糖酶（Xyn）、阿拉伯呋喃糖苷酶（AbfB）、阿魏酸酯酶（FAE）等若干種酶的協(xié)同作用(Collins,2005)，形成一個(gè)復(fù)雜的降解系統(tǒng)：Xyn 作用于主鏈上，是當(dāng)中首要的降解酶，隨機(jī)將長(zhǎng)鏈的木聚糖水解為短鏈的低聚木糖AX(雷釗,2017)；AbfB 則快速移除側(cè)鏈上的阿拉伯糖，更好地為Xyn 提供作用位點(diǎn)，同時(shí)提升了底物的溶解度(解西柱，2018)；FAE破壞阿拉伯呋喃糖O-5位形成阿魏酸酯鍵，簡(jiǎn)化AX結(jié)構(gòu)，暴露出更多的作用位點(diǎn)(Rahmani,2018)。

降解木聚糖，首先考慮的是木聚糖酶，我們可以把木聚糖酶理解或者設(shè)定為主效酶。但是，復(fù)雜的側(cè)鏈影響了一般的木聚糖酶的效率，這時(shí)候，就需要考慮輔效酶，這里是側(cè)鏈酶的阿拉伯呋喃糖苷酶（AbfB）和阿魏酸酯酶（FAE）。關(guān)于AbfB 和FAE 并不如木聚糖酶（Xyn）為人們所熟知。側(cè)鏈上含有阿拉伯殘基的木聚糖很難直接被Xyn所降解，主要由于其復(fù)雜的支鏈結(jié)構(gòu)增強(qiáng)了它的抗降解性。Nghiem(2011)的研究表明，針對(duì)玉米，單一使用Xyn，只能降解不到2%的木糖，當(dāng)協(xié)同添加FAE和Xyn，可以降解44%的木糖，表明FAE 是一個(gè)很重要的支鏈降解酶。國(guó)外已經(jīng)把FAE 應(yīng)用在飼料行業(yè)，研究表明，在青貯飼料中添加FAE，發(fā)現(xiàn)對(duì)消化率有明顯的提高。王林林(2015)將被FAE酶解過(guò)的麥糟復(fù)配至肉雞日糧中，發(fā)現(xiàn)肉雞日增重有提升的同時(shí)，料肉比降低了7.63%。

小麥和玉米的NSP主要是阿拉伯木聚糖，分別達(dá)干物質(zhì)的7.3%和4.7%（Bach Knudsen,2014）。簡(jiǎn)單的木聚糖能夠被木聚糖酶水解，然而，復(fù)雜的阿拉伯糖替代方式降低了木聚糖酶的效率，特別是玉米及其副產(chǎn)品的情況（Bach Knudsen,2014）。阿拉伯呋喃糖苷酶（Abf）可以在木糖主鏈骨架上切除阿拉伯糖，為木聚糖酶作用提供方便（De la Mare 等，2013），最終提高了木聚糖酶的效率。盡管水解木聚糖并沒(méi)有直接提供更多的能量，但由于消除了木聚糖的抗?fàn)I養(yǎng)性而提高了日糧的消化效率（Wiseman,2000；McCracken等，2002）。

為了研究主鏈酶（木聚糖酶）和側(cè)鏈酶（阿拉伯呋喃糖苷酶及阿魏酸酯酶）的配合作用，探討其協(xié)同效果，作者學(xué)生鄭達(dá)文（2019）進(jìn)行了相關(guān)試驗(yàn)，實(shí)質(zhì)就是主效酶與輔效酶協(xié)同理念的實(shí)踐。為了進(jìn)一步探討主效酶與輔效酶的含義與關(guān)系，我們這里以廣泛存在于谷物中復(fù)雜木聚糖的解決方案中使用的多酶復(fù)合體為例。

我們的試驗(yàn)（鄭達(dá)，2019）選取兩種常見(jiàn)高纖維原料小麥麩皮和燕麥麩皮，其水可溶性膳食纖維SDF和水不可溶性膳食纖維IDF，分析復(fù)雜木聚糖降解的輔效酶，即兩種新型支鏈降解酶：阿拉伯呋喃糖苷酶（AbfB）和阿魏酸酯酶（FAE）的酶學(xué)特性，并作用在不同溶解度的膳食纖維DF上，以體外仿生消化酶解試驗(yàn)，找出木聚糖酶（Xyn）與AbfB、FAE的最佳協(xié)同配比，并通過(guò)動(dòng)物試驗(yàn)驗(yàn)證在飼料中添加新型復(fù)合酶對(duì)斷奶仔豬生長(zhǎng)性能及腸道環(huán)境的改善效果。動(dòng)物試驗(yàn)分為三個(gè)處理組，空白對(duì)照組飼喂不添加外源酶的基礎(chǔ)日糧，酶A和酶B組在飼喂基礎(chǔ)日糧的基礎(chǔ)上按400 g/t的劑量添加酶制劑A（含木聚糖酶、α-淀粉酶、蛋白酶、甘露聚糖酶）和酶制劑B（木聚糖酶、α-淀粉酶、蛋白酶、甘露聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶和阿魏酸酯酶）。

在添加主效酶Xyn 的基礎(chǔ)上額外分別加入輔效酶AbfB或FAE，HPLC法和DNS法測(cè)定還原糖的結(jié)果如圖3 所示，還原糖總釋放量能提高11%或10.5%，Xyn 與AbfB 或FAE 最佳添加比例為3 000:1 或500:1，AbfB 或FAE 均能提高Xyn 的切割效率，對(duì)于還原糖的總體釋放量有顯著的提高作用。通過(guò)提取得到純度達(dá)95%的不同溶解度的DF，并按最佳添加比在DF中加入Xyn和AbfB或FAE，還原糖生成量顯著提高（P＜0.05）、干物質(zhì)消化率和能量消化率均明顯提升的趨勢(shì)（0.05＜P＜0.1）（鄭達(dá)文，2019）。

圖3 Xyn與AbfB處理淀粉小麥麩產(chǎn)生還原糖的協(xié)同作用

SDS體外仿生消化儀評(píng)估顯示，對(duì)比常規(guī)外源酶A組和空白對(duì)照組，額外添加AbfB或FAE的酶B組的各項(xiàng)表觀消化指標(biāo)均有提升的趨勢(shì)（0.05＜P＜0.1），其中：DM%、CP%、Ash%、GE%分別提高0.49%和3.44%、0.57%和3.62%、0.54%和3.71%、0.67%和3.79%。

由表1 可知，對(duì)比常規(guī)外源酶A 組和空白對(duì)照組，額外添加AbfB 和FA 的酶B 組的各項(xiàng)生長(zhǎng)性能指標(biāo)均有較明顯的提升趨勢(shì)（0.05＜P＜0.1），仔豬ADG、ADFI分別提高3.93%和11.39%、10.77 g/d和18.31 g/d，F(xiàn)CR 和腹瀉率則分別下降1.73%和7.52%、0.38%和0.7%，其中腹瀉率表現(xiàn)出顯著下降（P＜0.05）。額外添加阿拉伯呋喃糖苷酶和阿魏酸酯酶的B 組比只添加木聚糖酶的A 組，平均日增重從377.62 g/d 提高到391.43 g/d，有改善效果，但未達(dá)到顯著水平，而減少腹瀉率方面則有顯著效果（鄭達(dá)文，2019）。

另外，加酶組盲腸內(nèi)容物中乙酸、丙酸、丁酸和總VFA 含量均比空白對(duì)照組表現(xiàn)出升高的趨勢(shì)（0.05＜P＜0.1）或顯著提升（P＜0.05）；額外添加AbfB、FAE 的酶B 組比常規(guī)外源酶A 組，丙酸呈現(xiàn)升高的趨勢(shì)（0.05＜P＜0.1），乙酸、丁酸和總VFA 含量極顯著提升（P＜0.01）。在結(jié)腸內(nèi)容物中，加酶組的乙酸、丙酸和總VFA 含量均比空白對(duì)照組表現(xiàn)出顯著提升（P＜0.05）或極顯著提升（P＜0.01）；酶B 組比酶A 組，乙酸和總VFA含量極顯著提升（P＜0.01），丙酸則呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)（0.05＜P＜0.1）。

表1 主效酶（Xyn）和輔效酶（AbfB、FAE）協(xié)同對(duì)斷奶仔豬生長(zhǎng)性能的影響

試驗(yàn)得出的結(jié)果表明：在含有阿拉伯木聚糖AX的纖維飼料原料中，添加AbfB、FAE能夠與主效酶發(fā)揮協(xié)同作用，提高主鏈酶的降解效率，增加總還原糖的釋放量，從而更充分地分解日糧中的抗?fàn)I養(yǎng)成分，促進(jìn)養(yǎng)分消化和吸收，提升斷奶仔豬的日增重和日采食量，優(yōu)化動(dòng)物的腸道環(huán)境，降低料肉比和腹瀉率（鄭達(dá)文，2019）。

雷釗（2017）進(jìn)行了肉雞方面的試驗(yàn)，研究木聚糖酶與支鏈酶協(xié)作產(chǎn)生的產(chǎn)物作為益生元對(duì)腸道乳酸菌增殖的影響。

圖4顯示，圖4a：未經(jīng)酶解的麥麩表明光滑；圖4b：木聚糖酶處理麥麩表面結(jié)構(gòu)受到了破壞呈現(xiàn)典型的蜂窩狀結(jié)構(gòu)；圖4c：額外添加阿拉伯呋喃糖苷酶；圖4d阿魏酸酯酶都可以進(jìn)一步破壞其表面結(jié)構(gòu)。圖4e：同時(shí)添加2 種支鏈酶，麥麩表面的蜂窩狀結(jié)構(gòu)最為明顯。掃描電鏡較為形象地證明了2 種支鏈酶與內(nèi)切型木聚糖酶的協(xié)同效應(yīng)。

圖4 去淀粉麥麩經(jīng)木聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶和阿魏酸酯酶酶解處理后的掃描電鏡

添加木聚糖酶可以增加1～21 d和1～36 d肉雞的平均日增重，并顯著降低肉雞的料肉比（P＜0.05)；額外添加阿拉伯呋喃糖苷酶和阿魏酸酯酶均可以進(jìn)一步改善木聚糖酶的效果，提高肉雞的生長(zhǎng)性能，在肉雞36 d 時(shí)，與單獨(dú)添加木聚糖酶組相比，同時(shí)添加3 種酶制劑可以顯著提高肉雞的平均日增重（P＜0.05)，降低料肉比（P＜0.05)（雷釗，2017）。由阿拉伯呋喃糖苷酶、阿魏酸酯酶和內(nèi)切型木聚糖酶組成的特異性木聚糖降解酶，能有效地降解木聚糖，生成XOS。XOS 提高乳酸菌內(nèi)編碼ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和碳水化合物代謝中的關(guān)鍵酶基因的表達(dá)，促進(jìn)乳酸菌的增殖，產(chǎn)生更多的丁酸，進(jìn)而改善肉雞的腸道健康和生產(chǎn)性能。

綜上所述，鄭達(dá)文（2019）和雷釗（2017）分別進(jìn)行的豬雞的試驗(yàn)，額外添加阿拉伯呋喃糖苷酶和阿魏酸酯酶這兩種木聚糖的支鏈酶（側(cè)鏈酶），比單純使用木聚糖酶這種木聚糖主鏈酶效果更好，無(wú)論是還原糖、木糖、木寡糖釋放，還是體外仿生消化效率，甚至動(dòng)物生產(chǎn)性能及腸道微生物菌群和產(chǎn)物等方面都有差異和積極的效果。

上面討論到的這種主鏈酶與側(cè)鏈酶的相互配合、協(xié)同作用的存在，說(shuō)明了Bhat等（2001）在討論自然條件下復(fù)雜底物的酶作用存在“多酶復(fù)合體”，而他們同時(shí)也提出了是否其中各個(gè)單酶有相對(duì)效率之問(wèn)，以此出發(fā)，在纖維類日糧中使用木聚糖酶及相關(guān)糖苷酶的試驗(yàn)基礎(chǔ)上，我們提出了“主效酶”與“輔效酶”的概念，實(shí)際上，這種主次之分的酶制劑也可能存在于其他類成分，如蛋白與植物鹽結(jié)合體，甚至脂類成分等。這里特別比較一下主效酶和輔效酶與常常提到的主鏈酶及側(cè)鏈酶（或支鏈酶）的關(guān)系，后者的范圍更窄，只是適合物料底物是以鏈狀存在，其實(shí)除了化學(xué)組分差別影響酶發(fā)揮作用有別外，物理結(jié)構(gòu)不同同樣造成酶作用的變異。這兩種情況體現(xiàn)在組合酶與配合酶的單酶關(guān)系。如果把動(dòng)物日糧效果看成一個(gè)整體，復(fù)合酶這類在作用物理結(jié)構(gòu)及化學(xué)成分關(guān)聯(lián)度不高的酶，同樣也存在一種主次之別，存在主效酶與輔效酶的區(qū)別。這種單酶之間關(guān)系與效率的區(qū)分，為飼料酶制劑的設(shè)計(jì)與配制的科學(xué)基礎(chǔ)，飼料酶使用的選擇與性價(jià)比的考慮都有一定的意義，可以進(jìn)一步深化和細(xì)化飼料酶的應(yīng)用。