飼料中添加殼聚糖對方斑東風螺稚螺生長性能和免疫相關酶活性的影響

■李軍濤 邱承浩 冼健安 陳惠琴 張秀霞 魯耀鵬 鄭佩華 王冬梅

(中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶生物技術研究所海南省海洋生物資源功能性成分研究與利用重點實驗室，海南海口571101)

殼聚糖又稱脫乙酰甲殼素，是甲殼素(chitin)脫乙酰基后得到的一種帶正電荷的高分子堿性多糖，化學名稱為聚葡萄糖胺(1-4)-2-氨基-B-D，也是迄今為止所發(fā)現(xiàn)的唯一一種堿性多糖。甲殼素廣泛存在于低等動物尤其是節(jié)肢動物(如蝦、蟹和昆蟲)的外殼中，也存在于真菌、藻類細胞壁中，資源豐富。全世界每年蟹、蝦等水產(chǎn)品加工后的甲殼廢棄物有100多萬噸，其中含有10%～30%的甲殼素[1]。如果能變廢為寶，意義重大。近年來，國內(nèi)外專家學者通過對鯉魚(Cyprinus carpio)[2]、虹鱒(Oncorhynchus mykiss)[3]、羅非魚(Oreochromis mossambicus)[4]、草 魚(Ctenopharyngodon idellus)[5]、暗紋東方鲀(Takifugu obscurus)[6]、三角魴(Megalobrama terminalis)[7]、真鯛(Pagrosomus major)[8]、中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)[9]、斑節(jié)對蝦(Penaeus monodon)[10]等水產(chǎn)動物通過浸泡和口服殼聚糖的方法應用于試驗中，研究發(fā)現(xiàn)在水產(chǎn)動物的養(yǎng)殖中添加適宜濃度的殼聚糖能夠調(diào)節(jié)營養(yǎng)物質(zhì)代謝、促生長及增強免疫性能等效果，可用于替代傳統(tǒng)化學藥物及抗生素的使用，推動水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。但殼聚糖在方斑東風螺的飼料添加方面的研究尚未見報道，本試驗擬在方斑東風螺的配合飼料中添加不同梯度的殼聚糖，探究不同添加梯度下對方斑東風螺生長性能和免疫相關酶活性的影響。方斑東風螺人工飼料正處在研發(fā)推廣的關鍵時期，以期能為高效人工配合飼料的研發(fā)奠定基礎。

1 材料方法

1.1 試驗飼料

基礎飼料組成及營養(yǎng)水平見表1，配制飼料前先將飼料原料充分粉碎，過80目篩，其中不添加殼聚糖的基礎飼料作為對照組，分別在基礎飼料中添加0.2%、0.6%、1%殼聚糖作為3個試驗組。按照配方比例，再加入30%的水分在V型混合機中混勻30 min。將配好的各組飼料分別儲存在-20 ℃冰箱中備用。飼喂前解凍至室溫，加入適當比例的水投喂。

表1 基礎飼料組成及營養(yǎng)水平

1.2 飼養(yǎng)管理

該養(yǎng)殖試驗是在海南省瓊海市長坡鎮(zhèn)青葛村的養(yǎng)殖場進行。選取體格健壯，活力良好，無病害的方斑東風螺稚螺480顆，隨機分為4個組，每組3個重復，隨機分到12個養(yǎng)殖試驗箱中于室內(nèi)養(yǎng)殖，養(yǎng)殖箱的規(guī)格為50 cm×40 cm×40 cm，每個箱中放入螺苗40 顆，逐一編號，記錄各組初始總重。養(yǎng)殖箱中鋪3～4 cm 厚的沙，養(yǎng)殖用海水經(jīng)砂濾池過濾，試驗采取24 h 流水養(yǎng)殖，馴養(yǎng)期一周左右，馴養(yǎng)期間投喂對照組飼料。試驗期間各組飼喂各自對應的飼料，日飼喂量約為螺總重的5%左右，并根據(jù)實際攝食情況進行調(diào)整，飼料放置于玻璃培養(yǎng)皿中方便收集殘餌、觀察攝食情況及減少對養(yǎng)殖箱中沙子的污染，每天16：00 投喂，養(yǎng)殖周期為90 d。

1.3 樣品采集與測定

養(yǎng)殖試驗周期結束后，停食24 h。取樣時將方斑東風螺沖洗干凈后稱重，進行液氮速凍，運回實驗室后放入-80 ℃冰箱待測。從冰箱取出樣品，待適當解凍后敲碎螺殼，取出螺肉和內(nèi)臟，分離肝胰腺，用生理鹽水清洗后測定計算生長指標，免疫酶活性檢測。

1.4 生長性能計算公式

增重率(WG，%)=100×(終末螺均重-初始螺均重)/初始螺均重

肉殼比(meat shell rate)=螺肉的質(zhì)量(g)/螺殼的質(zhì)量(g)

臟體比(VSI，%)=100×內(nèi)臟團重(g)/螺體重(g)

肥滿度(CF)=肉重(g)/螺體重(g)

1.5 免疫功能測定

過氧化物酶(POD)活性、總抗氧化能力(T-AOC)、微量丙二醛(MDA)含量、溶菌酶(LZM)活性、酸性磷酸酶(ACP)活性、堿性磷酸酶(AKP)活性，測定均采用購自南京建成生物試劑公司試劑盒，酶活性的測定方法按照試劑盒的說明書測定。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)處理采用軟件SPSS 22.0 對4 個組進行單因素方差分析(one-way ANOVA)和Duncan's法多重比較，所得試驗結果均采用“平均值±標準差”的形式表示，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 添加殼聚糖對方斑東風螺稚螺生長性能的影響(見表2)

表2 添加殼聚糖對方斑東風螺稚螺生長性能的影響

由表2 可知，1%和0.6%殼聚糖添加組方斑東風螺稚螺的成活率分別達到了94.17%和92.5%，明顯高于對照組，差異顯著(P＜0.05)，0.2%殼聚糖添加組與對照組相比差異不顯著(P＞0.05)，成活率為89.17%也高于對照組，表明添加殼聚糖可以提高方斑東風螺稚螺的成活率；各殼聚糖添加組與對照組相比在增重率、肥滿度、肉殼比、臟體比都沒有出現(xiàn)顯著性差異(P＞0.05)。隨著殼聚糖添加量的增加，方斑東風螺稚螺的增重率呈現(xiàn)逐漸加大的趨勢，說明添加殼聚糖能夠一定程度的提高對餌料的利用效率，加快生長速度。肥滿度、肉殼比、臟體比的趨勢是先增加后下降，均在0.6%殼聚糖添加組出現(xiàn)最大值，結果表明添加殼聚糖后方斑東風螺的可食用部分增加，螺體的比例得到一定程度的優(yōu)化。

2.2 添加殼聚糖對方斑東風螺稚螺免疫相關酶活性的影響(見圖1～圖5)

由圖1可知，0.6%殼聚糖添加組方斑東風螺肝胰臟中的ACP 活性明顯高于對照組和1%殼聚糖添加組，差異顯著(P＜0.05)，其他組間沒有出現(xiàn)顯著差異；在0.2%和0.6%殼聚糖添加組方斑東風螺肝胰臟中AKP 的活性明顯高于對照組和1%殼聚糖添加組，差異顯著(P＜0.05)。方斑東風螺肝胰臟中ACP和AKP的活性隨著殼聚糖添加量的增加都呈現(xiàn)出先增加后下降的趨勢。

圖1 肝胰臟中ACP和AKP活性

由圖2可知，0.2%殼聚糖添加組的方斑東風螺肝胰臟中溶菌酶的活性明顯高于對照組和0.6%殼聚糖添加組，差異顯著(P＜0.05)，0.6%殼聚糖添加組明顯低于1%殼聚糖添加組，差異顯著(P＜0.05)，但與對照組差異不顯著(P＞0.05)。

圖2 肝胰臟中溶菌酶活性

圖3 肝胰臟中POD活性

圖4 肝胰臟中T-AOC活性

由圖3可知，對照組方斑東風螺肝胰臟中的POD的活性明顯高于0.2%和1%殼聚糖添加組，差異顯著(P＜0.05)，達到46.8 U/mg prot.，其他組間沒有出現(xiàn)顯著差異；方斑東風螺肝胰臟中POD的活性隨著殼聚糖添加量的增加呈現(xiàn)出下降趨勢。

0.6%殼聚糖添加組方斑東風螺肝胰臟中T-AOC活性最高，達到11.78 U/mg prot.，如圖4 所示，明顯高于對照組、0.2%和1%殼聚糖添加組，差異顯著(P＜0.05)，其他組間差異不顯著(P＞0.05)，方斑東風螺肝胰臟中T-AOC的活性隨著殼聚糖添加量的增加都呈現(xiàn)出先增加后下降的趨勢。

圖5 肝胰臟中MDA含量

0.2%殼聚糖添加組方斑東風螺肝胰臟中MDA含量最高，達到57.93 nmol/mg prot.，如圖5 所示。0.2%和0.6%殼聚糖添加組的MDA含量明顯高于對照組和1%殼聚糖添加組，差異顯著(P＜0.05)。方斑東風螺肝胰臟中MDA含量隨著殼聚糖添加量的增加呈現(xiàn)出下降的趨勢。

3 討論

3.1 添加殼聚糖對方斑東風螺稚螺生長性能的影響

殼聚糖是一種應用較為廣泛的免疫增強劑，主要通過：①吸附H+，結合體內(nèi)酸性物質(zhì), 抑制、中和胃酸分泌，保護胃黏膜；②促進腸內(nèi)有益菌群的繁殖，抑制有害菌群的滋生及減少大腸桿菌生長的機會，調(diào)整腸道生態(tài)環(huán)境，提高魚體消化機能；③提高腸道和肝胰臟的蛋白酶、淀粉酶，以及肝臟極低密度脂蛋白的活性；④在飼料表面形成一層保護膜，延長水化時間，保護飼料養(yǎng)分，防止霉變不污染水源等途徑提高生長性能和飼料利用率[11]。本試驗研究發(fā)現(xiàn)在飼料中梯度添加殼聚糖方斑東風螺稚螺的成活率呈現(xiàn)持續(xù)增加的趨勢，添加量為1%時成活率最高為94.17%，可能是由于殼聚糖作為免疫增強劑一方面抑制了病原菌在螺體的滋生，另一方面增強方斑東風螺自身的免疫性能，體質(zhì)增強，成活率增加，該結果與添加殼聚糖對方斑東風螺稚螺免疫性能的影響一致；添加0.6%的殼聚糖后方斑東風螺的肥滿度、肉殼比和臟體比在對照組和各試驗組中達到最大值，而當其添加量繼續(xù)增加時，方斑東風螺的肥滿度、肉殼比和臟體比反而有所下降。說明添加量為0.6%的殼聚糖可以提高方斑東風螺的肥育程度，可食用部分增加，而超過1%的添加量則對該幾種指標無益。此結果與羅非魚飼料最適殼聚糖添加量0.5%[12]、花鱸飼料最適添加量0.5%[13]一致，可能是因為殼聚糖具有很強的吸附離子和蛋白質(zhì)的能力，過量添加時吸附了生長所必需的營養(yǎng)物質(zhì)，而導致消化吸收能力的下降。

3.2 添加殼聚糖對方斑東風螺稚螺免疫性能的影響

殼聚糖可以提高白細胞吞噬率，提高補體活性[14]，提高殺菌力，增強免疫酶活性，增強呼吸爆發(fā)作用，促進抗體合成，可能的作用機制是調(diào)節(jié)免疫細胞中NO和PGE2二種生物活性物質(zhì)的生成[15]，從而達到對非特異性免疫和特異性免疫都能產(chǎn)生作用。本研究發(fā)現(xiàn)，添加0.6%殼聚糖時方斑東風螺肝臟中的ACP和AKP活性達到最大，且與對照組差異顯著(P＜0.05)，隨著殼聚糖添加量的增加呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢，這與劉金海等[15]研究發(fā)現(xiàn)的在半滑舌鰨飼料中梯度添加(0、300、600、900、1 200、1 500、1 800 mg/kg)黃芪多糖得到的結果一致，另外在松浦鏡鯉幼魚(Cyprinus specularis)[16]飼料中添加維生素D3后酸性磷酸酶活性的變化，王維新等[17]在仿刺參(Apostichopus japonicus)24 h 體內(nèi)堿性磷酸酶活性的變化得到結果類似的；添加0.2%殼聚糖后方斑東風螺肝胰臟中溶菌酶的活性明顯高于對照組，差異顯著(P＜0.05)，0.6%殼聚糖添加組方斑東風螺肝胰臟中T-AOC 活性最高，達到11.78 U/mg prot.。明顯高于對照組差異顯著(P＜0.05)，這與周永昌等[18]研究發(fā)現(xiàn)添加1.0 g/kg 的復方種草藥可以提高雄體中華絨螯蟹幼蟹血清中T-SOD、T-AOC酶活性，降低肝胰臟中MDA的含量；凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）飼料中添加益生菌可以提高CAT(對 照 組43.22 U/ml，試 驗 組76.33 U/ml)，TSOD(對照組60.61 U/ml，試驗組101.18 U/ml)的活性[19]、羅氏沼蝦飼料中添加黨參、黃芪等中草藥可以提高溶菌酶及酚氧化酶的活力[20]的結果類似。說明添加殼聚糖能夠提高方斑東風螺的免疫相關酶的活性，但是不同的酶活性最大的添加梯度表現(xiàn)不一致，可能的原因是不同的免疫相關酶基因表達差異造成的，具體的原因有待進一步研究。從對方斑東風螺養(yǎng)殖成本和對生長性能、免疫相關酶活性的綜合考慮，0.6%殼聚糖的添加量最適宜。