家蠅蛹的營養成分分析及抗氧化肽制備工藝研究

■孫婷婷 楊文哲 張思晨 趙志敏 何國瑞 楊得坡*

（1.中山大學藥學院生藥與天然藥化實驗室，廣東廣州510006；2.廣州賽萊拉干細胞科技股份有限公司，廣東廣州510006；3.廣東省現代中藥工程技術研究開發中心，廣東廣州510006)

自由基是細胞正常代謝的一類產物，在體內具有雙重作用，在中低濃度時，可誘導細胞分化、增殖和遷移；參與防御感染因子，屬于先天免疫系統的重要部分；同時還是多種細胞信號通路的信號分子[1]。但當體內的氧化還原體系失去平衡，累積大量極不穩定的自由基時，它們又會損傷核酸、蛋白質、脂質以及各種細胞結構，從而誘發細胞凋亡，甚至壞死，嚴重時則引起各種疾病，包括癌癥[2]、心血管疾病[3]、關節炎[4]、神經退行性疾病等年齡依賴性疾病[5-7]。研究表明，體內的氧化應激反應也與衰老存在著密切的聯系[8-9]。近些年來，人們對這些慢性疾病的密切關注為抗氧化劑的應用提供了廣大的平臺。目前常用的抗氧化劑主要包括化學合成的抗氧化物質[如叔丁基對羥基茴香醚（BHA）、二丁基羥基甲苯（BHT）等]和天然來源的抗氧化物質[如抗壞血酸（VC）、谷胱甘肽（GSH）以及一些酶類[10]]。由于化學合成的抗氧化劑存在潛在的急性毒性和發育毒性[11]，天然抗氧化劑的應用得以擴大。過去的二十年間，從可食用動植物中發現新的抗氧化肽成為研究的熱點[12]，抗氧化肽具有低毒高效，容易吸收的特點，目前主要從水產品和可食用植物中得到，對昆蟲資源的開發十分匱乏。

家蠅（Musca Domestica）是一種完全變態的資源型昆蟲，分布廣泛，常見于垃圾堆、糞池中，以腐爛的動物殘骸、糞便、餐廚垃圾為食，具有強大的防御系統。因其生長周期短、繁殖能力強、幼蟲的營養成分豐富，已被開發成飼料及飼料添加劑[13-14]。臨床上使用家蠅幼蟲進行清創治療，可減少傷口的感染，促進傷口的愈合[15]。有研究發現，蠅蛆體內含有豐富的耐高溫抗氧化多肽[16]，蠅蛆酶解多肽具有清除自由基的能力[17]，蠅蛆粉可以通過調節UCP4 和CyclinD1 信號通路，以及調制JNK和P38信號通路來防御阿爾茲海默癥小鼠體內的氧化應激損傷[18]。但是目前對家蠅的研究主要集中在幼蟲階段，對蛹的研究幾乎空白。蛹是家蠅變態發育過程中的重要階段，對生存條件要求極低，含有十分豐富的生物質，且其蛋白質與幼蟲階段的蛋白質存在一定差異，是開發新的生物活性物質的一個重要來源。

研究以家蠅蛹為對象，分析其組成成分，并分別用水提醇沉法、熱變性法和酶解法這三種方法制備得到家蠅蛹抗氧化肽，通過對比得率、多肽含量、分子量分布以及抗氧化活性，比較三種方法制備抗氧化肽的特點及優劣，為家蠅蛹的應用開發提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

家蠅蛹由廣東盈亨生物科技有限公司提供，經中山大學藥學院楊得坡教授鑒定為雙翅目蠅科家蠅的蛹。

堿性蛋白酶（20 萬U/g）購自北京索萊寶科技有限公司；1,1-二苯基-2-苦基苯肼（DPPH）、氯化亞鐵（FeCl2）、菲洛嗪、鄰苯二甲醛、還原型谷胱甘肽（標準品）、VC（標準品）購自上海麥克林生化科技有限公司；二硫蘇糖醇（DTT）購自阿拉丁（上海）有限公司；總抗氧化能力檢測試劑盒（ABTS 法）、總抗氧化能力檢測試劑盒（FRAP 法）、Bradford 蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE 凝膠配制試劑盒、快速銀染試劑盒購自碧云天生物技術公司；無水乙醇、硫酸亞鐵（Fe-SO4）、水楊酸、四硼酸鈉、乙二胺四乙酸二鈉等分析純試劑購自天津大茂化學試劑廠。

1.2 儀器與設備

電熱恒溫鼓風干燥箱，上海森信實驗儀器有限公司；低溫高速離心機，德國HERMLE 公司；集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，鞏義市予華儀器有限責任公司；多功能酶標儀，德國BMG 公司；pH 計，上海三信儀表廠；旋轉蒸發儀，鞏義市予華儀器有限責任公司；冷凍干燥機，德國Christ公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

收集家蠅鮮蛹，洗凈，低溫處死后烘干，粉碎后過24 目篩，得到家蠅蛹粉。采用索氏抽提法，正己烷為溶劑對家蠅蛹粉進行脫脂，通風櫥內揮干溶劑，得到家蠅脫脂蛹粉，保存于4 ℃待用。

1.3.2 家蠅蛹的成分分析

總蛋白質的含量用凱氏定氮法測定[19]；脂肪含量采用索氏抽提法測定[20]，正己烷作為提取溶劑；總糖含量采用硫酸-苯酚法測定[21]；灰分采用高溫灼燒法測定[22]。

將得到的家蠅蛹粉提供給華南理工大學測試中心進行水解氨基酸測試。

1.3.3 水提醇沉法制備家蠅蛹抗氧化肽

根據王芙蓉等[23]的方法，準確稱取家蠅脫脂蛹粉10 g，按料液比1∶20用雙蒸水低溫浸提30 min，于5 000 r/min 離心10 min，取上清液，重復浸提3 次，合并上清液，加入無水乙醇至終濃度為75%，在低溫中靜置2 h 以上，5 000 r/min 離心10 min，取上清液，用旋轉蒸發儀濃縮后在冷凍干燥機中干燥，得到家蠅蛹抗氧化肽，稱重，計算得率。

1.3.4 熱變性法制備家蠅蛹抗氧化肽

根據王土連等[16]的方法，準確稱取家蠅脫脂蛹粉10 g，按料液比1∶20 加入雙蒸水，在80 ℃中水浴處理30 min，于5 000 r/min離心10 min，取上清液，在冷凍干燥機中干燥，得到家蠅蛹抗氧化肽，稱重，計算得率。

1.3.5 酶解法制備家蠅蛹抗氧化

參考鄭榮等[24]的方法，并根據實際情況改進部分條件，準確稱取家蠅脫脂蛹粉10 g，加入20倍量的雙蒸水，混勻，在100 ℃中水浴10 min 使蛋白質變性，冷卻至酶解的溫度，調pH值至9.5，加入8 000 U/g的堿性蛋白酶（按底物質量計算），在55 ℃中恒溫油浴1 h，迅速放入100 ℃水浴中滅活10 min，冷卻至室溫，于5 000 r/min 離心10 min，取上清液，在冷凍干燥機中干燥，得到家蠅蛹抗氧化肽，稱重，計算得率。

1.3.6 OPA法檢測多肽的含量

游離的胺基與鄰苯二甲醛（OPA）反應可生成黃色絡合物，在340 nm 處有特征吸收。本研究采用OPA 法檢測樣品中的多肽含量，OPA 試劑配制如下：準確稱取1.905 g 硼砂，50 mg 十二烷基硫酸鈉，溶于30 ml 雙蒸水，配得溶液A；準確稱取40 mg OPA，溶于1 ml 無水乙醇，轉移至溶液A 中；準確稱取44 mg 1,4-二巰基蘇糖醇（DTT），加入溶液A 中溶解；最后用雙蒸水定容至50 ml，配得OPA 試劑。

繪制標準曲線及樣品檢測：使用還原型谷胱甘肽標準品繪制標準曲線，配制系列濃度（0.062 5、0.125、0.25、0.5、1 mg/ml）的還原型谷胱甘肽標準溶液。將20 μl 樣品溶液和150 μl 的OPA 試劑混勻，精確反應2 min，在340 nm 波長處檢測吸光度，繪制濃度-吸光度標準曲線。將樣品配制成1 mg/ml 的溶液，實驗步驟同上，利用標準曲線公式計算多肽含量。

1.3.7 多肽的分子量分布

用聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）-銀染的方法檢測多肽的分子量分布。考馬斯亮藍法測定樣品中的蛋白質含量，每個泳道上樣20 μg，電泳完成后進行銀染觀察。

1.3.8 DPPH自由基清除能力

取50 μl 0.4 mmol/l DPPH的乙醇溶液和50 μl樣品溶液加入96孔板，混勻后靜置30 min，于519 nm測得吸光度。VC 和谷胱甘肽作為陽性對照。DPPH 自由基的清除率按照下式計算：

清除率（%）=[1-(A2-A1）/A0]×100

式中：A0——空白組，以蒸餾水代替待測溶液量(ml)；

A1——對照組，以無水乙醇代替DPPH溶液量(ml)；

A2——試驗組，即加入待測溶液量(ml)。

1.3.9 ABTS自由基清除能力

根據試劑盒的方法，在96 孔板中加入200 μl ABTS 工作液和10 μl 待測溶液，混勻后室溫孵育5 min，于740 nm 處檢測吸光度。維生素C 和谷胱甘肽作為陽性對照。ABTS 自由基清除率按照下式計算：

清除率（%）=（1-A1/A0）×100

式中：A0——空白組，以蒸餾水代替待測溶液量(ml)；

A1——試驗組，即加入待測溶液量(ml)。

1.3.10 羥基自由基清除能力

采用水楊酸-硫酸亞鐵反應體系，將8 μl 18 mmol/l水楊酸、52 μl 樣品溶液、8 μl 18 mmol/l FeSO4溶液混勻，加入32 μl 0.1% H2O2啟動反應，靜置30 min，于510 nm處檢測吸光度。VC作為陽性對照。羥基自由基清除率按照下式計算：

清除率（%）=[1-(A2-A1）/A0]×100

式中：A0——空白組，以蒸餾水代替待測溶液量(ml)；

A1——對照組，以蒸餾水代替FeSO4溶液量(ml)；

A2——試驗組，即加入待測溶液量(ml)。

1.3.11 FRAP法測試還原能力

標準曲線測定：配制系列濃度（0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mmol/l）的標準物質FeSO4·7H2O，96 孔板的每個檢測孔中加入180 μl FRAP 工作液、5 μl待測溶液，37 ℃孵育3～5 min，于539 nm 測定吸光值，繪制濃度-吸光度曲線。根據標準曲線計算樣品的還原能力，表示為N mg/ml 樣品的還原能力為X mmol/l FeSO4·7H2O。VC 和谷胱甘肽作為陽性對照。

1.3.12 亞鐵離子螯合能力

亞鐵離子能與菲洛嗪絡合形成紫色絡合物，在562 nm 處有特征吸收，本文采用亞鐵離子-菲洛嗪體系檢測抗氧化肽的亞鐵螯合能力。將70 μl待測溶液、10 μl FeCl2溶液、20 μl 菲洛嗪溶液混合均勻，室溫孵育10 min，于562 nm 測得吸光度。EDTA-2Na 作為陽性對照。亞鐵離子螯合能力按照下式計算：

亞鐵離子螯合能力（%）=[1-(A2-A1）/A0]×100

式中：A0——空白組，以蒸餾水代替待測溶液量(ml)；

A1——對照組，以蒸餾水代替FeCl2溶液量(ml)；

A2——試驗組，即加入待測溶液量(ml)。

1.3.13 單因素試驗優化酶解工藝

本文探索了酶解溫度、時間和加酶量三個因素對產物抗氧化能力的影響。a. 酶解溫度：在料液比為1∶20、pH 值9.5、時間30 min、加酶量8 000 U/g 的條件下，考察系列酶解溫度（45、50、55、60、65 ℃）對產物的DPPH 自由基清除能力的影響；b. 酶解時間：在料液比為1∶20、pH 值9.5、溫度55 ℃、加酶量8 000 U/g 的條件下，考察系列酶解時間（15、30、45、60、75 min）對產物的DPPH 自由基清除能力的影響；c. 加酶量：在料液比為1∶20、pH 值9.5、溫度55 ℃、時間30 min的條件下，考察系列加酶量（2 000、4 000、6 000、8 000、10 000 U/g）對產物的DPPH 自由基清除能力的影響。

1.4 數據分析

所有試驗均重復3次，取“平均值和標準偏差”作為最終結果，用GraghPad Prism 5.0軟件處理數據。

2 結果

2.1 家蠅蛹的成分分析（見表1、表2）

表1 家蠅蛹的主要成分分析（n=3，%）

表2 家蠅蛹的氨基酸組成（g/100 g蛹粉）

如表1 所示，雞蛋、牛乳、大豆、柞蠶蛹和秘魯魚粉均是目前市場上高蛋白質的食品或飼料，家蠅蛹的營養成分豐富，蛋白質含量為63.13%，高于雞蛋、牛乳、大豆和柞蠶蛹，與秘魯魚粉的蛋白質含量相當。而脂肪含量低于雞蛋、牛乳和柞蠶蛹，略高于大豆，具有開發成高蛋白質飼料添加劑的潛力。

家蠅蛹的氨基酸組成如表2，共檢測了17種氨基酸，合計約54.6 g/100 g蛹粉，其中必需氨基酸占總氨基酸（EAA/TAA）的36.26%，說明家蠅蛹具有較好的營養價值。研究發現[25]，肽中疏水氨基酸、芳香族氨基酸以及酸性氨基酸的含量與抗氧化活性具有密切的聯系。疏水氨基酸可與脂肪酸自由基結合，中斷自由基鏈式反應；芳香族氨基酸是質子供體，通過共振平衡，使吲哚自由基和苯氧自由基保持穩定；酸性氨基酸側鏈結構中的羧基殘基會對一些金屬離子（Fe2+、Cu+）具有鈍化作用。本研究的結果顯示，家蠅蛹中酸性氨基酸占總氨基酸的20.15%，疏水性氨基酸占總氨基酸的48.90%，芳香族氨基酸占總氨基酸的12.27%，這三類與抗氧化活性相關的氨基酸占總氨基酸的56.96%，表明家蠅蛹中極可能含有豐富的抗氧化肽段。

2.2 抗氧化肽的制備得率及多肽含量（見表3）

表3 三種方法制備抗氧化肽的產率及多肽含量對比(%)

表3的研究結果顯示，酶解法制備抗氧化肽的得率最高，達到70.80%，是熱變性法（25.11%）和水提醇沉法（18.35%）的兩倍以上。根據圖1 所示的標準曲線進行計算，采用還原型谷胱甘肽作為標準物質，檢測計算得到多肽的濃度與吸光度之間的標準曲線，曲線的相關系數較高，根據標準曲線進行計算，酶解法得到的多肽類物質最高，占終產物的66.50%，水提醇沉法和熱變性法的效率不及酶解法，分別提取到53.87%和43.33%的多肽。

圖1 OPA法測多肽含量的標準曲線

2.3 抗氧化肽的分子量分布

三種方法制備的抗氧化肽的SDS-PAGE-銀染結果如圖2，酶解法制備的抗氧化肽主要集中在10 kD及以下；熱變性法制備的抗氧化肽主要有三個分子段，包含分子量在60～70 kD的熱穩定性蛋白、分子量在35～45 kD 的熱穩定性蛋白質以及分子量在10 kD及以下的肽段。對比來看，酶解法可以將大分子量的蛋白質水解成較小的肽段，且肽類的含量豐富，熱變性法制備的不僅含有多肽，還存在大量蛋白質，水提醇沉法能夠將大分子的蛋白質除盡，但小分子量的肽段也會被部分除去。

圖2 三種方法制備的抗氧化肽的分子量分布

2.4 抗氧化肽的活性研究

圖3、圖4、圖5 為三種方法制備的抗氧化肽的自由基清除能力對比圖，VC 或谷胱甘肽為陽性對照。由圖可知，三種方法制備的抗氧化肽均具有DPPH自由基、ABTA自由基和羥基自由基清除能力，且都具有濃度依賴性。熱變性法制備的抗氧化肽的自由基清除能力最強，在0.25 mg/ml的濃度下，DPPH自由基清除率就達到了82.5%，超過了同等濃度的谷胱甘肽；在2 mg/ml 的濃度下，羥基自由基清除率達到了100%。酶解法制備的抗氧化肽的自由基清除能力也較強，在0.625 mg/ml 的濃度下，DPPH 自由基清除率達到82.3%；當酶解物的濃度為4 mg/ml 時，羥基自由基清除率達到91.2%。相比之下，水提醇沉法制備的抗氧化肽活性最弱。三種方法制備的抗氧化肽的自由基清除能力的IC50值如下：①DPPH自由基清除能力的IC50：0.383（WAM）、0.108（TDM）、0.324 mg/ml（EHM）；②ABTS 自由基清除能力的IC50：1.924（WAM）、0.604（TDM）、0.971 mg/ml（EHM）；③羥基自由基清除能力的IC50：2.227（WAM）、0.704（TDM）、1.684 mg/ml（EHM）。

圖3 三種方法制備的抗氧化肽的DPPH自由基清除能力

圖4 三種方法制備的抗氧化肽的ABTS自由基清除能力

圖5 三種方法制備的抗氧化肽的羥基自由基清除能力

圖6是FRAP法檢測三種方法制備的抗氧化肽的還原能力的結果，從圖中的結果可知，三種方式制備的抗氧化肽的還原能力均大于谷胱甘肽，其中熱沉淀法的活性最好，水提醇沉法和酶解法制備的抗氧化肽的還原能力相似。

圖7 是三種方法制備的抗氧化肽的亞鐵離子螯合能力結果，EDTA-2Na作為陽性對照。圖中的結果顯示，酶解法和熱變性法制備抗氧化肽的亞鐵離子螯合能力較強，水提醇沉法制備的抗氧化肽的活性較弱，但都具有濃度依賴性。其中，酶解法的活性最強，在濃度為3 mg/ml時，螯合能力就達到了95%以上，其次為熱變性法，這兩種方法制備的多肽在6 mg/ml 的濃度時，螯合能力都趨近于100%。三種方法制備的抗氧化肽的亞鐵離子螯合能力的IC50值分別為：9.677（WAM）、0.994（TDM）、0.567 mg/ml（EHM）。

圖6 FRAP法檢測三種方法制備的抗氧化肽的還原能力

圖7 三種方法制備的抗氧化肽的亞鐵離子螯合能力

綜合來看，熱變性法和酶解法制備的多肽的抗氧化活性較好，而水提醇沉法的活性較弱，活性的高低可能與蛋白質空間結構的打開程度以及活性肽段的暴露程度有密切聯系。但熱變性法制備的產物中多肽含量不高，含有較多的熱穩定性蛋白質，可能也貢獻了部分抗氧化活性[16]。結合上面的試驗結果，熱變性法可制備得到熱穩定性的抗氧化肽/蛋白質，酶解法制備的產物中多肽類物質含量豐富，抗氧化活性強，為發現家蠅蛹中新的抗氧化肽提供了技術手段支撐。

2.5 單因素試驗優化酶解工藝

單因素試驗的結果如圖8 所示，圖8(A)：溫度對酶解物的活性影響較為明顯，當溫度從45 ℃上升至60 ℃時，酶解物的DPPH 自由基清除率逐漸上升，酶解溫度為60 ℃時，清除率達到60.3%，當酶解溫度繼續上升時，酶解物的自由基清除能力呈現下降的趨勢，可能與高溫破壞了堿性蛋白酶的活性有關；圖8(B)：當酶解時間為30 min 時，酶解物的自由基清除能力達到最大值，為59.4%，之后隨著提取時間延長，活性呈緩慢降低趨勢，可能是水解過度的原因；圖8(C)：加酶量對酶解物的活性影響較弱，當加酶量為6 000 U/g 時，酶解物的活性最好，再增加加酶量，酶解物的自由基清除能力趨于穩定。

圖8 單因素試驗優化酶解工藝

綜上所述，確定最佳的酶解條件為溫度60 ℃、時間30 min、加酶量6 000 U/g，在此條件下，0.5 mg/ml的酶解物的DPPH自由基清除率為61.7%。

3 結論

本研究分析了家蠅蛹的基本成分，家蠅蛹含有豐富的蛋白質和脂質，且氨基酸成分中與抗氧化活性相關的芳香族氨基酸、疏水性氨基酸和酸性氨基酸含量較高，占總氨基酸成分的56.96%，為制備抗氧化肽提供了依據。隨后，用水提醇沉法、熱變性法和酶解法制備得到了家蠅蛹抗氧化肽，其中酶解法制備抗氧化肽的產率最高，達到70.80%，酶解物中的多肽含量最高，達到66.50%，且該方法制備的抗氧化肽主要集中在10 kD 及以下，不含大分子的蛋白質，所以該方法制備多肽的效率最高。對比三種方法制備的抗氧化肽的活性可知，熱變性法制備的抗氧化肽（含有部分大分子的熱穩定性蛋白質）清除自由基的能力和對Fe3+還原能力最強，而酶解法制備的抗氧化肽的亞鐵離子螯合能力最強，說明以上兩種方法均可作為篩選抗氧化活性物質的方案，結合家蠅蛹的氨基酸成分分析，也進一步論證了家蠅蛹中含有豐富的抗氧化活性的肽類物質。最后，本研究還進一步優化了酶解法的工藝條件，單因素結果顯示，在溫度60 ℃、時間30 min、加酶量6 000 U/g 的條件下，可以獲得自由基清除能力最強的酶解物。至于家蠅蛹中或家蠅蛹的酶解物中發揮抗氧化活性的具體成分，還有待進一步的研究。