Periostin對骨質疏松大鼠牙槽骨缺損修復效果的影響

李豆豆 周維維 曹猛

骨髓間充質干細胞（BMMSCs）是骨組織工程中最常用的種子細胞［1］。骨質疏松狀態時，BMMSCs的功能發生異常，由BMMSCs進行組織修復并不能達到良好的效果［2］。成骨特異性細胞因子2（periostin，POSTN），是相對分子質量為93 000的分泌型細胞外基質蛋白，主要在膠原豐富的結締組織中表達，如骨（尤其是骨膜）、牙周韌帶和心臟瓣膜［3］。POSTN受機械應力、PTH、生長因子等因素的影響參與調節骨內穩態［4］。目前治療骨質疏松的唯一骨代謝藥是小劑量、間歇性的給予PTH，而在所有受PTH調控的基因中，POSTN被證明是一種高反應基因［5-6］。POSTN在絕經后骨質疏松癥的發病機理中扮演著重要的角色。

本實驗通過模擬雌激素缺乏引起的骨質疏松狀態，研究POSTN基因在去勢大鼠BMMSCs中的表達和對其成骨分化能力的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和主要材料、儀器

實驗動物：4周齡雌性SD大鼠（第四軍醫大學動物實驗中心提供）。

主要實驗材料和儀器：α-MEM培養基（Hyclone，美國）；胎牛血清（杭州四季青公司）；胰蛋白酶、地塞米松、β-甘油磷酸鈉、吲哚美辛、抗壞血酸、胰島素、油紅O、茜素紅（Sigma-Aldrich，美國）；BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒、BCA（北京康為世紀）；RIPA裂解液（上海碧云天公司）；堿性磷酸酶試劑盒（南京建成公司）；RNAiso Plus、SYBR?Premix Ex TaqTMII（Takara，日本）；Micro-CT（Siemens Inveon，德國）；實時定量PCR儀（Prime Q，英國）；酶聯免疫檢測儀（BioTek Synergy HT，美國）；CO2孵箱、離心機（Thermo，美國）。

1.2 去勢大鼠模型的構建

16只體重180～200 g、4周齡SD大鼠根據是否摘除卵巢分為去勢組（OVX，n=8）和假手術組（SHAM，n=8），去勢組結扎雙側輸卵管并切除卵巢，假手術組僅切除卵巢周圍等量脂肪組織。3個月后處死大鼠，無菌條件下剔除股骨周圍軟組織，并對股骨進行Micro-CT掃描和重建，隨后比較2組指標，包括小梁厚度（Tb.Th），小梁數目（Tb.N），小梁間距（Th.Sp）和骨體積分數（BV/TV）。動物福利及所有手續均按照《實驗室動物護理使用指南》（中國科技部，2006）執行，并經第四軍醫大學倫理委員會批準。

1.3 細胞分離與培養

無菌條件下取SD大鼠股骨及脛骨。充分暴露骨髓腔，用添加青、鏈霉素的α-MEM培養基沖出骨髓，反復輕輕吹打均勻，接種于25 cm2培養瓶中，置37℃、5%CO2和飽和濕度的培養箱中培養。48 h后半換液，以后每3天換液。當細胞融合至80% ～90%時，0.25%胰蛋白酶傳代培養，細胞傳至P3代使用。

1.4 Real-Time PCR

用RNAiso Plus提取細胞總RNA，以20μl體系將RNA反轉錄為cDNA。反應條件為：37℃15 min；85℃5 s；4℃。使用SYBR?Premix Ex TaqTMII進行Real-Time PCR實驗。反應條件為：95℃30 s；95℃5 s、55℃30 s、72℃1 min共39個循環。引物具體見表1。結果以Ct值表示，以GAPDH為內參照，以2-ΔΔCt計算基因相對表達量。

1.5 病毒轉染

攜帶POSTN的病毒（上海吉凱基因），病毒序列為 GV492（Ubi-MCS-3FLAG-CBh-gcGFP-IRES-puromycin）。細胞以5×104個/ml的密度接種在6孔板中，細胞貼壁后，用含有6μg/ml促細胞感染液（Polybreen）的2 ml新鮮培養液代替原培養基，并分別加入35μl攜帶有綠色熒光蛋白（eGFP）的免疫缺陷病毒AdPOSTN和AdE（空載體陰性對照）于培養基中［病毒體積=（MOI×細胞數目）/病毒滴度，預實驗探索出當MOI=70%左右時可同時保證較高的感染效率和良好的細胞狀態，本實驗病毒滴度=1×108TU/ml］，轉染12 h后更換為常規培養基。感染后72 h在熒光顯微鏡下觀察轉染的陽性率，Real-time PCR和Western Blotting檢測POSTN的表達量。

表1 RT-PCR引物Tab 1 RT-PCR primers

1.6 細胞膜片的構建

細胞以3×105個/孔的濃度接種于6孔培養板，待細胞貼壁生長至密度達90% ～100%時，更換成膜誘導液（培養基添加100 mg/ml維生素C）。每3 d換液1次，7～10 d后可獲得細胞膜片。

1.7 牙周缺損動物模型

24只4周齡SD大鼠按前述切除卵巢，術后3個月分為3組：對照組，OVX-BMMSCs組和POSTNOVX-BMMSCs組。無菌條件下，腹腔注射2%戊巴比妥鈉麻醉，仰臥位固定大鼠，提拉上下頜骨使盡量暴露其上頜牙列。用尖頭手術刀切開上頜第一磨牙近中腭側牙齦，輕輕翻開粘骨膜瓣，暴露第一磨牙近中根的牙槽骨骨面后，用直徑為1.5 mm的牙科球狀車針去除大鼠上頜第一磨牙近中根的近中牙槽骨，直至車針完全沒入。柱狀車針修整洞型使其達到手術標準統一為3 mm×2 mm×1.5 mm的箱裝洞型，體積為9 mm3。OVX-BMMSCs組和POSTN-OVX-BMMSCs組在缺損處分別小心植入OVX-BMMSCs膜片和POSTN-OVXBMMSCs膜片，將粘骨膜瓣縫合。對照組不植入僅縫合。第3、6周進行Micro-CT掃描和重建分析。6周后麻藥過量處死，分離上頜骨并用10% EDTA脫鈣30 d左右，石蠟包埋，HE染色。

1.8 統計學分析

采用SPSS 17.0對進行統計分析，兩獨立樣本比較用成組t檢驗，3組樣本比較用one-way ANOVA，檢驗水準為α=0.05，P＜0.05為差異有顯著性。

2 結 果

2.1 成功構建去勢大鼠模型

本實驗摘除SD大鼠的雙側卵巢后3個月對大鼠股骨進行Micro-CT掃描和三維重建（圖1）。與SHAM組相比，OVX組股骨的密度減少，可見斷裂的骨小梁及骨髓空腔（圖1）。OVX組Tb.Th、Tb.N和BV/TV等指標比SHAM組顯著降低，而Th.Sp顯著增加（圖1），說明OVX組大鼠嚴重骨質疏松。

圖1 骨質疏松大鼠模型的鑒定Fig 1 Identification of an ovariectomized（OVX）rat model

2.2 OVX-BMMSCs內POSTN表達水平降低

采用PCR檢測POSTN的表達水平，發現OVXBMMSCs的POSTN的表達量比SHAM-BMMSCs明顯降低（P＜0.05）（圖2）。

2.3 上調POSTN的表達

轉染72 h后用熒光顯微鏡觀察eGFP的表達效率，AdPOSTN和AdE轉染效率均在70% ～80%之間（圖2）。PCR檢測OVX-BMMSCs轉染病毒后POSTN的mRNA表達水平，結果顯示POSTN-OVX-BMMSCs內POSTN含量顯著上調（P＜0.001）（圖2）。

2.4 上調POSTN促進OVX-BMMSCs的骨向分化

成骨誘導培養SHAM-BMMSCs，OVX-BMMSCs和POSTN-OVX-BMMSCs 3組細胞，第3天和第7天檢測相關成骨水平，顯示OVX-BMMSCs與SHAM-BMMSCs相比，前者成骨正相關ALP、OCN和Runx2的mRNA表達水平明顯降低，成骨負相關Sost表達水平升高。POSTN-OVX-BMMSCs和OVX-BMMSCs相比，前者的ALP、Runx2和OCN等mRNA表達水平整體呈升高趨勢，Sost的表達水平降低（圖3）。

圖2 POSTN在3組細胞中的表達Fig 2 The expression level of POSTN in BMMSCs

圖3 Periostin對BMMSCs成骨分化影響Fig 3 Influence of POSTN on osteogenic differentiation of BMMSCs

2.5 構建細胞膜片

在成膜誘導液中培養BMMSCs，7～10 d左右可見細胞成膜狀（圖4A）。HE染色可見細胞膜片的厚度，橫斷面可見由3～5層細胞構成（圖4B）。

2.6 體內實驗POSTN促進牙周缺損的修復

經過3周、6周，對大鼠上頜骨進行Micro-CT掃描，掃描重建后結果顯示（圖5）：在相同的時間點，POSTN-OVX-BMMSCs膜片組牙槽骨缺損處體積最小，愈合速度最快；OVX-BMMSCs膜片組次之。6周后對牙槽骨缺損處矢量狀向切片并進行HE染色結果顯示（圖6），POSTN-OVX-BMMSCs膜片組新生牙槽骨面積最大，有明顯的新生血管及大量的成熟成骨細胞，骨組織結構較完整，而空白組和OVX-BMMSCs膜片組中只有少量的成骨細胞和血管形成。以上均提示POSTN-OVX-BMMSCs膜片組修復牙槽骨缺損的能力明顯強于OVX-BMMSCs細胞膜片和對照組。

圖4 細胞膜片的構建Fig 4 Construction of cell sheets

圖5 骨缺損區進行Micro-CT掃描Fig 5 Micro-CT scanning of the defect area

3 討 論

骨質疏松的患者常常遭受骨折和骨折后難以愈合的困擾，極大降低了生活質量［7］。骨髓間充質干細胞較容易分離，有多向分化潛力，并保留“歸巢”特點，使得它們在骨組織修復以及治療相關疾病中成為第一選擇。然而，雌激素缺乏的骨質疏松大鼠的BMMSCs骨向分化能力降低、成骨水平下降，由自體BMMSCs移植進行骨再生的修復效果并不理想，而恢復受損的BMMSCs的正常功能可能是治療的關鍵［8］。

圖6 骨缺損區進行HE染色Fig 6 HE staining of the defect area

POSTN是一種分泌型的細胞外基質蛋白，最初是從小鼠成骨細胞系MC3T3-E1 cDNA文庫中克隆出的一種具有調節成骨細胞分化和粘附功能的分子［9］。POSTN屬于成束蛋白-I家族，此家族的蛋白與成骨關系密切，POSTN在調節全身骨代謝中發揮了關鍵性作用［10-11］。運動能改善骨質疏松，而運動產生復雜的機械效應，如重復壓縮或剪切力等，大大增加了POSTN的表達，同時POSTN通過semaphorin-3A抑制破骨細胞分化［12］。骨折后POSTN的表達水平再一次升高，說明POSTN在骨代謝中有重要作用［13］。這些研究提示POSTN在骨發育和重塑過程中具有重要作用。

本實驗通過摘除雙側卵巢成功構建了骨質疏松大鼠模型，并分離培養了OVX-BMMSCs和SHAMBMMSCs。通過PCR檢測骨質疏松大鼠中POSTN的表達水平，發現OVX-BMMSCs的POSTN的表達量比SHAM-BMMSCs明顯降低。OVX-BMMSCs的骨向分化能力存在明顯缺陷，這與以前的許多研究都是一致的［14］。通過逆轉錄病毒成功上調POSTN的表達后，PCR結果顯示POSTN-OVX-BMMSCs的成骨水平高于OVX-BMMSCs，這闡明上調POSTN可以恢復OVXBMMSCs的成骨能力。反過來，這也證實了POSTN可能是監測骨代謝活動的指標之一［15］。

POSTN與牙周關系密切，缺失小鼠牙齒發育異常，并在牙周炎以及牙周術后表達增加［16］。在本實驗應用細胞膜片技術，在骨缺損區分別植入OVXBMMSCs和POSTN-OVX-BMMSCs膜片。發現，在骨缺損區POSTN-OVX-BMMSCs膜片更能促進新生骨和血管的再生，促進骨的修復愈合，這與POSTN在組織創傷和傷口修復的組織中高表達有關［17］。

4 結 論

POSTN可改善和促進去勢大鼠BMMSCs的成骨能力，可能有利于絕經后骨質疏松大鼠骨的再生。