糜爛型口腔扁平苔蘚差異表達MicroRNAs的篩選

高勝男 李言君 李建衛 崔彩云 李煥煥 王雯虹

口腔扁平苔蘚（oral lichen plauns，OLP）是一種常見的慢性炎癥性自身免疫性黏膜疾病，發病率在一般人群中約為0.1%～4%，OLP的臨床表現從無癥狀的白色網狀病損到有癥狀的萎縮性糜爛型紅色病損，呈多樣化表現。糜爛型OLP是OLP中最嚴重的病損類型，患者具有明顯的臨床癥狀，且有癌變潛能。本研究采用miRNAs芯片篩選糜爛型OLP病損黏膜相比正常黏膜差異表達的miRNAs，有助于闡明糜爛型OLP發病分子機制及尋找特異性治療靶點，對具有癌變傾向OLP的診斷及治療具有重要的理論意義和應用價值。

1 材料與方法

1.1 材料

RNAlater?（賽默飛世爾科技，美國）；Trizol?試劑（Invitrogen life technologies公司，美國）；Biopulverizer冷凍組織粉碎缽、勻漿器（Mini-Bead-Beater-16）（Biospec公司，美國）；-80℃超低溫冰箱、HVE-50高壓蒸汽消毒鍋（Sanyo公司，日本）；NanoDrop ND-1000超微量分光光度計、Baseline-ZERO DNase（EPICENTER公司，美國）；RNasey Mini Kit、miRNA Complete Labeling and Hyb Kit、雜交室，雜交室密封墊片基、雜交烤箱、安捷倫微陣列雜交室用雜交烤箱旋轉器、Gene Expression Wash Buffer Kit、安捷倫微陣列掃描儀（安捷倫科技公司，美國）；磁力攪拌棒、磁力攪拌板（康寧公司，美國）；帶載玻片架的滑動染色皿（Thermo Shandon p/n 121，美國）。

1.2 實驗對象和分組

收集濱州醫學院附屬醫院口腔黏膜科糜爛型OLP病損部位黏膜組織患者3例，活檢切取局部黏膜5 mm×5 mm，分為2份，一份送常規組織病理學診斷，一份留存于-80℃冰箱備用。待OLP病損組織經組織病理學診斷確診后納入實驗。同時，采集口腔頜面外科正常口腔黏膜組織3例，阻生齒拔除術中切下的多余牙齦組織。組織經RANlater?浸泡并在4℃條件下孵育過夜后轉入-80℃冰箱冰凍保存。實驗方案經醫院倫理委員會均簽署知情同意書。

1.3 實驗方法

1.3.1 總RNA提取和質量控制 使用Biopulverizer將冷凍組織粉碎，Mini-Bead-Beater-16勻漿后，加入TRIzol?試劑，按其說明書提取組織樣本總RNA。RNasey Mini試劑盒純化miRNA和總RNA，通過NanoDrop ND-1000測定RNA在230、260、280 nm的吸收值。以評估RNA是否降解并測定RNA濃度。RNA完整性需通過甲醛變性凝膠電泳進行評估。并取得RNAQC報告。純RNA的A260/A280比率應該接近2.0（1.8和2.1之間的比率是可接受的），A260/A230的比例應該大于1.8。

1.3.2 RNA標記和雜交 來自每個組織樣本的miRNA在T4 RNA ligase作用下用Cyanine 3-pCp標記，標記產物濃縮干燥后用水重溶，標準條件下標記好的探針在Agilent微陣列上雜交。將干燥的樣品重懸于無核酸酶水中，配制雜交液加入，100℃溫育5 min，然后立即轉移到冰浴中5 min，將雜交體系置于55℃的雜交爐中，將雜交旋轉器設置為以20 r/min的速度旋轉，在55℃下雜交20 h。用基因表達洗滌緩沖液試劑盒（Agilent p/n 5188-5327）洗滌雜交芯片以備掃描。實驗過程按照標記和雜交試劑盒的說明書完成。

1.3.3 芯片掃描 Agilent微陣列掃描儀（Agilent p/n G2505C）掃描雜交芯片后，使用Agilent Feature Extraction軟件采集芯片探針信號值。使用GeneSpring GX v 12.1軟件（Agilent Technologies）進行芯片標準化。

1.3.4 生物信息學分析 應用以下miRNA生物信息庫對miRNA目標預測：TargetScan（http：//www.targetscan.org），miRPathDBv1.1（https：//mpd.bioinf.unisb.de/），DIANAMicroT（http：//diana.imis.athena-innovation.gr/DianaTools/index.php），miRDB（http：//mirdb.org/）。選取至少3個軟件預測到的靶基因作為今后實驗將驗證的目標靶基因。

1.4 統計學分析

使用Agilent Feature Extraction軟件（v 11.0.1.1）獲得芯片圖，并讀值，得到原始數據。采用百分位平移法對所有數據進行歸一化并對數轉化，相比正常黏膜組織，糜爛型OLP黏膜組織中差異表達的miRNAs，根據Benjamini Hochberg FDR方法得到修正的P值（即FDR）進行篩選，默認Fold Change≥2.0，FDR≤0.05。與P值篩選相比，該方法能夠降低假陽性率。使用R腳本進行層次聚類。

2 結 果

2.1 實驗組織樣本總RNA抽提結果

A260/A280比率均在1.8～2.0之間，A260/A230的比例均大于1.8（表1）。電泳實驗結果：28S和18S核糖體RNA帶明亮、清晰，條帶銳利，上頻條帶強度約為下頻條帶的2倍，說明樣本組織RNA沒有降解，已提取高純度RNA（圖1）。證明可以進行下一步實驗。

表1 實驗組織樣本總RNA的質檢和定量Tab 1 Quality inspection and quantification of total RNA in experimental tissue samples

2.2 miRNA芯片結果

芯片原始數據經過標準化處理后，在一個二維直角坐標系平面中，繪制散點圖，可清晰、明顯的反應樣本間的變化，所有數據采用同一標準。X軸：該點在對照樣本芯片中標準化后的信號值。Y軸：該點在實驗樣品芯片中標準化后的信號值。從由熒光信號值構成的散點圖來看，整個圖呈現較為集中的趨勢，絕大多數無差異表達信號值位于45°角平分線附近，差異表達信號值則發生偏離（圖2）。證明原始數據的標準化是正常的。

圖1 6例實驗組織樣本提取的總RNA甲醛變性凝膠電泳圖Fig 1 Standard denaturing gel electropherogram of the total RNA extracted from 6 experimental tissue samples

圖2 實驗樣本熒光信號值散點分布圖Fig 2 The scatter plot of the fluorescence signal values

根據Benjamini Hochberg FDR方法得到修正的P值（即FDR）進行差異miRNA篩選，默認Fold Change＞2.0，FDR＜0.05。篩選出159個差異表達的miRNAs（上調＞2倍或下調＜2倍），表達上調的有12個，表達下調的有147個（圖3）。用差異表達的159個miRNAs對所有標本的系統聚類分析（圖4），其中差異表達＞4倍的有18個，其中表達上調的有6個，表達下調的有12個（表2）。

2.3 靶基因預測結果

篩選出miR-206、miR-133b為在糜爛型OLP的研究中作為感興趣的miRNA，利用miRNA生物信息庫TargetScan、miRPathDBv1.1、，DIANAMicroT、miRDB對其進行靶基因的預測。選擇至少3個軟件預測到的靶基因，以減小假陽性率。miR-206篩選出39個預測靶基因，通過查閱相關文獻最終篩選出5個與糜爛型OLP相關的預測靶基因，miR-133b最終篩選出1個預測靶基因（表3）。

圖3 糜爛型OLP黏膜組織和正常黏膜組織差異表達的miRNAsFig 3 Differentially expressed miRNAs in erosive OLPmucosa and normal mucosa

圖4 糜爛型OLP和正常組織黏膜中差異表達的159種miRNAsFig 4 159 miRNAs differentially expressed in erosive OLP and normal tissue mucosa

3 討 論

MicroRNAs（miRNAs）是一種內源性不編碼蛋白質的小分子RNA，通過與靶信使RNA（mRNA）的3'非翻譯區（UTR）進行不完全的堿基配對，減少目標mRNA的翻譯和/或誘導其降解，從而在轉錄后抑制蛋白質的表達［1］。研究證明miRNAs是調控細胞周期、細胞死亡、分化和免疫的不可缺少的分子。近來有學者開始探討研究miRNA與OLP相關關系［2］，已有研究證明相關miRNA可以通過其靶基因參與OLP發病及進展甚至惡變的過程或相關miRNA調節通路中的某種物質可能通過與淋巴細胞的相互作用，共同介導OLP的免疫調節［3-4］。但是針對于miRNA與糜爛型OLP相關性的研究較少。探討其相關miRNA有助于闡明糜爛型OLP的分子發病機制，對具有癌變傾向OLP的診斷及治療具有重要的理論意義和應用價值。

表2 糜爛型OLP中18個差異表達4倍以上的miRNAsTab 2 18 miRNAs with more than 4 times differential expression in erosive OLP

表3 miR-206和miRv133b分別相關的靶基因Tab 3 miR-206 and miR-133b respectively related target genes

本研究中采用靶向人類2 549個miRNAs的基因芯片，篩選出159個差異表達2倍以上的miRNAs，其中12個表達上調，147個表達下調。本研究結果中出現了miR-206、miR-133b的高表達，已有研究發現miR-206、miR-133b通過其靶基因調控，參與乳腺癌、胃癌、胰腺癌、肝癌等多種癌性疾病的發生及進展［5-8］，且其中STC2［9］、ANXA2［10］、TAGLN2［11］等多個靶基因與口腔鱗狀細胞癌（OSCC）的發生相關。本研究提示miR-206和miR-133b可能在糜爛型OLP的發生及惡性轉化中起重要作用，其具體調控機制仍需進一步研究。

本研究發現在糜爛型OLP和正常黏膜組織中差異表達＞4倍的miRNAs共18個，其中miR-1-3p、miR-133a-3p、miR-133b、miR-206的差異＞30倍，這些明顯差異表達的miRNAs的在糜爛型OLP發生中的作用機制尚不清楚，本實驗采用4個miRNA生物信息庫對miR-206和miR-133b進行靶基因預測，其中有很多涉及細胞周期調控、增殖、信號轉導和細胞凋亡的靶基因，有研究發現靶基因KIF2A在口腔鱗狀舌癌中過表達［12］；FNDC3B基因可在缺氧微環境中促進舌鱗狀細胞癌細胞的上皮-間質轉化［13］；BACH2介導TNF-α誘導的牙齦上皮細胞凋亡［14］。但具體調控機制尚未見報道。對這些差異表達的miRNA及其靶基因的深入研究，有助于進一步了解糜爛型OLP發病的分子生物學機制，并從中尋找可能的早期診斷分子生物學標志和基因治療的新靶點。

目前對于糜爛型OLP中特異miRNA表達譜的研究尚沒有一致的結論，今后的研究應擴大樣本量，驗證基因芯片篩選出的有明顯差異表達的miRNAs在糜爛型OLP中的表達，其靶基因和信號通路在糜爛型OLP中的具體調控途徑將是本研究下一步重點。