快速降解的彈性體（PGS/PCL）人工血管重建肌性功能性頸動(dòng)脈的實(shí)驗(yàn)研究

楊欣 楊帆 郭曉寶 吳煒 高瞻

由于頸動(dòng)脈功能和位置的特殊性，頸動(dòng)脈被腫瘤侵犯后，給手術(shù)治療術(shù)式的選擇帶來(lái)很大的挑戰(zhàn)［1-3］。連同被侵犯的頸動(dòng)脈與腫瘤整體切除的術(shù)式是業(yè)界比較認(rèn)可的可以減少?gòu)?fù)發(fā)率提高生存率的方式，但是頸動(dòng)脈切除后，如果不重建頸動(dòng)脈血流，會(huì)有不小的造成的神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥的機(jī)率。而頸動(dòng)脈結(jié)扎切除后重建頸動(dòng)脈可以有效減少神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥的發(fā)生［4-6］。

目前，頸動(dòng)脈重建常用到的方法有自體靜脈移植（大隱靜脈、股淺靜脈等）以及不可降解的惰性材料構(gòu)建的成品人工血管等。但均存在不同的缺陷［7-8］。

應(yīng)用聚癸二酸丙三醇酯［poly（glycerol sebacate），PGS］為主體構(gòu)建了雙層人工血管，PGS屬于一種彈性體，其彈性模量與動(dòng)脈接近。本實(shí)驗(yàn)研究旨在評(píng)估這種雙層人工血管重建頸動(dòng)脈的效果，為頸動(dòng)脈的重建提供一種更優(yōu)的選擇。

1 材料與方法

1.1 PGS/PCL雙層人工血管的構(gòu)建

PGS/PCL雙層人工血管的構(gòu)建與之前實(shí)驗(yàn)描述過(guò)的一樣，利用模具構(gòu)建鹽（NaCl）模，淋濾PGS溶液，真空干燥箱中加熱使PGS交聯(lián)。利用靜電紡絲技術(shù)將聚乙酸內(nèi)酯（PCL，polycaprolactone）納米纖維絲纏繞在鹽模上，將鹽模復(fù)合體浸入去離子水，去凈其中的鹽。構(gòu)建好PGS/PCL雙層人工血管，儲(chǔ)存在常溫干燥箱中，使用前環(huán)氧乙烷消毒消毒。

1.2 PGS/PCL雙層人工血管物理特性的分析

掃描電鏡（SME）檢測(cè)，修剪標(biāo)本，噴金處理，掃描電鏡（日立，S-4800，日本）觀察并且拍照片，管壁的厚度以及鞘層的厚度用掃描電鏡自帶的測(cè)量軟件進(jìn)行測(cè)量和記錄。彈性模量、拉伸強(qiáng)度和縫合強(qiáng)度的測(cè)量使用微小力拉扭試驗(yàn)機(jī)（BOSE，Electroforce 3200 seriesⅡ，美國(guó)）來(lái)測(cè)試。PGS/PCL人工血管截成大約2 mm小段，安裝到機(jī)器上，給予單向徑向的拉力，速度為2 mm/min，最大加力為10 N。縫合強(qiáng)度的測(cè)量，將9-0的顯微外科縫線從距PGS/PCL人工血管管口大約1 mm處穿出后打結(jié)，安裝到機(jī)器上，加力方式、強(qiáng)度和速率同前。

1.3 PGS/PCL人工血管手術(shù)植入大鼠頸動(dòng)脈

雄性SD大鼠10只，體重大約250～300 g，使用小動(dòng)物麻醉機(jī)，對(duì)大鼠行異氟醚吸入麻醉（5%誘導(dǎo)麻醉，2%維持麻醉），麻醉滿(mǎn)意后，在頸部正中切口暴露頸總動(dòng)脈，分離，血管夾兩頭夾住頸動(dòng)脈，切除大約5 mm頸動(dòng)脈，顯微外科方法吻合人工血管與頸動(dòng)脈兩端。術(shù)后未給予抗凝和抗血小板治療。12個(gè)月后，麻醉下（方法同前），分離并切取新生血管后，進(jìn)一步完成組織學(xué)，生物化學(xué)、掃描電鏡、機(jī)械力學(xué)等的分析。

1.4 血管造影（CTA）

按照45 mg/kg的劑量，腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉大鼠后，尾靜脈注射碘比醇（三代顯，法國(guó)加柏公司，50 ml）3 ml，GE Brightspeed 8排CT掃描大鼠全身，用其自帶軟件行三維成像重建。

1.5 新生血管的組織學(xué)分析

標(biāo)本用PBS漂洗后，OCT包埋劑包埋，冰凍切片機(jī)（萊卡生物，德國(guó)）切片厚度為5μm。4%的多聚甲醛中固定5 min后，分別行HE，馬松三色和偉郝夫范吉森染色，在正置顯微鏡（尼康551，日本）下觀察并拍照片。掃描電鏡分析的標(biāo)本，PBS漂洗后，2.5%的戊二醛溶液過(guò)夜固定，乙醇濃度梯度脫水的方法脫水，碳纖維膠帶黏貼到到掃描電鏡專(zhuān)用的鋁托上，噴金處理后，用掃描電鏡觀察并且拍照片。

1.6 免疫熒光染色

α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）的表達(dá)，選擇小鼠抗大鼠SMA單克隆抗體作為一抗；平滑肌肌球蛋白重鏈（MHC）的表達(dá)，選擇小鼠抗大鼠MHC單克隆抗體作為一抗；彈性蛋白和膠原蛋白的表達(dá)，選擇兔抗大鼠彈性蛋白多克隆抗體，和兔抗大鼠膠原I和膠原III多克隆抗體作為一抗。熒光二抗分別選擇山羊抗兔Alexa Fluor 488抗體（Jackson，USA）和山羊抗小鼠Alexa Fluor 488抗體，以及山羊抗兔Alexa Fluor594山羊抗小鼠Alexa Fluor 594抗體。未使用一抗的切片作為陰性對(duì)照，大鼠自體頸動(dòng)脈作為正常對(duì)照組。

1.7 生物化學(xué)定量分析（彈性蛋白、膠原蛋白、DNA）

彈性蛋白的定量分析使用了Biocolor彈性蛋白檢測(cè)試劑盒（Biocolor，F(xiàn)2000，UK）。依照產(chǎn)品說(shuō)明操作步驟，提取出可溶性的彈性蛋白，將管內(nèi)液體轉(zhuǎn)移到96孔板上，放入酶標(biāo)儀，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，比對(duì)后得出樣本中彈性蛋白的含量。膠原蛋白的定量分析使用了Biocolor膠原蛋白檢測(cè)試劑盒（biocolor，S1000，UK）。依照產(chǎn)品說(shuō)明操作步驟，逐步將標(biāo)本中的膠原蛋白提取出后，與染料結(jié)合，后根據(jù)染料的量比對(duì)出標(biāo)本中所含有的膠原蛋白的量。DNA的提取使用德國(guó)QIAGEN的DNA提取試劑盒，依照試劑盒詳述的操作步驟提取出標(biāo)本中的DNA后，比對(duì)出DNA的含量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均使用±s來(lái)表示，采用雙尾t檢驗(yàn)來(lái)比較差異。P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 PGS/PCL人工血管的微觀結(jié)構(gòu)和機(jī)械力學(xué)性能

PGS/PCL人工血管具有雙層結(jié)構(gòu)（圖1A），內(nèi)層為相互連通的多孔狀的PGS管芯（圖1B），外層為菲薄的PCL納米纖維鞘層結(jié)構(gòu)（圖1C）。PGS/PCL人工血管在對(duì)折180°后不會(huì)出現(xiàn)扭結(jié)的現(xiàn)象（圖1D）。菲薄的（12.27±0.79）μm PCL納米纖維鞘層將彈性模量從（153.47±71.80）kPa提高到（415.31 ±37.41）kPa（圖1G），抗拉強(qiáng)度從（110.67±14.35）kPa提高到（1 162.42±34.13）kPa（圖1F）。很大地提高了臨床使用的安全性。PGS/PCL人工血管的縫合強(qiáng)度（0.43±0.065）N顯著大于PGS管芯（0.12±0.017）N、靜脈血管（0.25±0.041）N以及9-0的顯微外科縫線（0.26±0.014）N的縫合抵抗力（圖1E）。

2.2 PGS/PCL人工血管在體內(nèi)的改建

人工血管在動(dòng)脈血流的高壓下，迅速變紅，PCL納米纖維鞘層迅速有效地阻止了血液的持續(xù)滲出，管壁未見(jiàn)明顯膨脹（圖2A）。12個(gè)月后，CTA和尸檢分析其通暢率為90%，未發(fā)現(xiàn)管腔狹窄以及動(dòng)脈瘤（圖2B）。

新生血管的彈性模量和斷裂強(qiáng)度分別是（122.92±47.12）kPa和（50.86±7.14）kPa，顯著大于靜脈的彈性模量和斷裂強(qiáng)度。而更加接近自體頸動(dòng)脈的彈性模量（361.09±93.02）kPa和斷裂強(qiáng)度（79.71±6.12）kPa（圖2C～D）。

圖1 PGS/PCL人工血管的微觀結(jié)構(gòu)和機(jī)械力學(xué)性能Fig 1 The microstructure and machinery mechanics of the PGS/PCL artificial vessel

圖2 PGS/PCL人工血管植入大鼠頸動(dòng)脈后觀察Fig 2 Observation of the PGS/PCL artificial vessel after transplantation in carotid artery of rats

2.3 PGS/PCL人工血管在體內(nèi)改建成了幾乎完全細(xì)胞化的肌性血管

HE染色可以發(fā)現(xiàn)，12個(gè)月后，PGS/PCL人工血管已經(jīng)幾乎完全發(fā)生了細(xì)胞化的改建，可見(jiàn)及細(xì)胞外基質(zhì)整齊地沿圓周方向排列，形成了與自體血管類(lèi)似的三層管壁結(jié)構(gòu)，即內(nèi)皮細(xì)胞層，平滑肌層以及疏松的外膜層（圖3 A、D）。新生血管DNA含量（2.36±0.35）μg/mg與自體血管的DNA含量（2.57±0.26）μg/mg沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（n=5，P＞0.05）（圖4I）。

α-SMA和MHC是平滑肌細(xì)胞的標(biāo)記性蛋白，免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)新生血管中膜層分布著大量的SMA和MHC陽(yáng)性表現(xiàn)的平滑肌細(xì)胞整齊地沿著圓周方向排列著（圖3B～C、E～F）。

新生血管的SEM影像證實(shí)管腔內(nèi)層覆蓋有一層平滑完整的內(nèi)皮細(xì)胞層，其上未發(fā)現(xiàn)明顯的血小板聚集和血栓形成（圖3H～I(xiàn)）。在新生血管與自體血管的連接處覆蓋有一層平滑連續(xù)的內(nèi)皮細(xì)胞，連接處有縫線作為標(biāo)記（圖3G）。

圖3 移植后12個(gè)月PGS/PCL人工血管的大鼠體內(nèi)改建Fig 3 Remodeling of the PGS/PCL artificial vessel 12 months after transplantation

2.4 新生血管沉積了適量的功能性細(xì)胞外基質(zhì)

免疫熒光染色提示新生血管里彈性蛋白的高表達(dá)，且按照?qǐng)A周方向排列（圖4C、F）。定量分析說(shuō)明新生血管中彈性蛋白含量（10.06±1.92）μg/mg高于自體靜脈血管中彈性蛋白的含量（5.72±0.76）μg/mg，新生血管彈性蛋白的含量接近自體動(dòng)脈彈性蛋白的含量（13.51±1.18）μg/mg，但仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖4H）。免疫熒光染色提示了新生血管中Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原的表達(dá)強(qiáng)度和排列方式均類(lèi)似于自體動(dòng)脈（圖4A～B、D～E）。膠原蛋白定量分析示新生血管中膠原蛋白的含量（51.76±7.21）μg/mg與自體動(dòng)脈血管中膠原蛋白的含量（58.73±3.24）μg/mg以及自體靜脈血管中膠原蛋白的含量（55.34±5.42）μg/mg無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖4G）。

3 討 論

目前臨床上常用于血管置換的自體血管和成品人工血管的所存在的局限性，影響并限制著頸動(dòng)脈等一些血管移植手術(shù)的開(kāi)展［12］。而無(wú)細(xì)胞植入的組織工程多數(shù)集中在慢降解的高分子聚合物材料的研究上［13-16］。而材料的長(zhǎng)期殘留會(huì)因?yàn)榉瓷w維包裹而是組織變硬鈣化，另外也會(huì)激活炎性細(xì)胞而引起內(nèi)膜的增生［17］。而本研究使用了快速降解的PGS彈性體作為主體材料構(gòu)建成人工血管，另外外層輔以一層菲薄的PCL納米纖維材料來(lái)增強(qiáng)機(jī)械力學(xué)強(qiáng)度，植入體內(nèi)后隨著PGS的快速降解為募集細(xì)胞的分化和生長(zhǎng)增殖提供了相應(yīng)的空間，而細(xì)胞的增殖和細(xì)胞外基質(zhì)的分泌又可以彌補(bǔ)PGS降解所損傷的機(jī)械力學(xué)強(qiáng)度。

PCL屬于慢降解材料，納米纖維材料在體內(nèi)至少保留1年以上［10］，這為募集細(xì)胞的分化生長(zhǎng)提供了穩(wěn)定的力學(xué)環(huán)境。因?yàn)轭i動(dòng)脈位于頸部，其活動(dòng)方式及活動(dòng)度的特殊性，以及頸動(dòng)脈血流速度相對(duì)于腹主動(dòng)脈慢，因此替換頸動(dòng)脈的血管移植體在血流速度相對(duì)較慢的情況下，需要承受更多的拉升扭曲等特殊情況下對(duì)于其通暢率的及細(xì)胞化的考驗(yàn)。如前述的結(jié)果表明PGS/PCL人工血管可以實(shí)現(xiàn)頸動(dòng)脈的肌性功能性的重建，在體內(nèi)可以改建成為大體結(jié)構(gòu)和組織學(xué)方面均與自體頸動(dòng)脈相似的動(dòng)脈血管，具有臨床應(yīng)用前景。

圖4 新生血管的生物學(xué)功能Fig 4 Biofunction of the newly reformed vessel

由于大鼠具有更強(qiáng)的重建潛能以及大鼠的內(nèi)皮細(xì)胞具有更強(qiáng)的覆蓋高分子材料等表面的能力，特別是相較老年人來(lái)說(shuō)［18-19］。因此，進(jìn)一步研究大動(dòng)物體內(nèi)的內(nèi)皮化程度和外科手術(shù)安全性的問(wèn)題是非常重要的。同時(shí)，細(xì)胞來(lái)源以及細(xì)胞分化機(jī)理的研究也是下一步研究的重點(diǎn)。