不同光敏劑對口腔常見致齲菌體外抗菌作用的比較研究

武韜 肖燕 周唯 方明 陳吉華

致齲菌是導致齲病發(fā)生和發(fā)展的最重要因素。口腔常見致齲菌包括變異鏈球菌、嗜酸乳桿菌、黏性放線菌等［1］。對致齲菌的有效殺滅或抑制生長，是控制齲病發(fā)生發(fā)展的重要手段。

光動力療法是利用光敏劑在光照條件下發(fā)生光動力反應，通過產(chǎn)生的單線態(tài)氧與自由基破壞細菌正常結構，從而發(fā)揮抗菌作用的一類治療方法。因其具有殺菌效率高、選擇性強，且不易產(chǎn)生耐藥性的特點，被逐漸用于口腔細菌和真菌感染的治療［2-3］。

光敏劑在光動力療法中作為能量的載體，其性能決定了光動力抗菌作用的強弱。本實驗選用6種在光動力療法中廣泛應用，生物相容性好的小分子光敏劑，通過比較它們在牙科LED光固化燈照射及無光照條件下對口腔常見致齲菌的體外抗菌作用，以期篩選得到合適的光敏劑與應用劑量，為光動力療法在齲病防治中的應用奠定實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 主要材料、試劑以及儀器

腦心浸液肉湯（brain heart infusion broth，BHI）、腦心浸液瓊脂（brain heart infusion agar，BHA）（青島海博生物）；實驗所用光敏劑：玫瑰紅、赤蘚紅、甲苯胺藍、亞甲基藍、核黃素、姜黃素，對照組：醋酸氯己定（Sigma-Aldrich，USA）；高壓鍋（MLS-380，三洋，日本）；移液器（Eppendorf，德國）；二氧化碳恒溫孵箱（HF151）、生物安全柜（1200，上海力康公司）；厭氧培養(yǎng)箱（H85，DWS，英國）；48孔板（3548，Corning，USA）；牙科LED光固化燈（Elipar，波長430～480 nm，3M，USA）。

1.2 受試菌株和培養(yǎng)條件

變異鏈球菌（UA 159）、嗜酸乳桿菌（ATCC 4356）和黏性放線菌（ATCC 15987）均采用BHI培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，在37℃厭氧環(huán)境（80%N2、10%CO2、10%H2）中孵育24～48 h。

1.3 各組試劑的配制

避光稱取0.011 g玫瑰紅，于錫箔紙包裹的15 ml離心管中，然后加入無菌水10 ml，充分震蕩搖勻，使其制成1 mmol/L玫瑰紅母液，采用二倍稀釋法，用無菌的BHI液倍比稀釋配置濃度分別為：64、32、16、8、4、2、1、0.5和0.25μmol/L的溶液。稱取0.044 g赤蘚紅用同樣的方法配置1 000、500、250、125、62.5、31.25和15.625μmol/L的溶液。分別稱取0.037 4 g甲苯胺藍與0.032 g亞甲基藍采用同樣方法配制100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.563和0.782μmol/L的溶液。分別稱取0.188 2 g核黃素和0.184 2 g姜黃素采用同樣方法配制10、5、2.5、1.25、0.625、0.312和0.156 mmol/L的溶液。稱取0.064 g醋酸氯己定采用同樣方法，配制100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.563和0.782μmol/L的溶液。

1.4 最小抑菌濃度（MIC）和最小殺菌濃度（MBC）測試

取上述玫瑰紅、赤蘚紅、甲苯胺藍、亞甲基藍、核黃素、姜黃素、醋酸氯己定各濃度的溶液1 ml加入48孔板中，每種光敏劑或者醋酸氯己定的每個濃度分為光照組與非光照組兩組，每組各加入3孔。據(jù)此方法依次將不同濃度光敏劑與醋酸氯己定溶液加入各個平板中。變異鏈球菌、嗜酸性乳桿菌、黏性放線菌經(jīng)傳代培養(yǎng)后用比濁儀配制成0.5麥氏單位菌懸液，然后10倍稀釋，此時菌濃度約1×107CFU/ml。設置以無添加光敏劑的無菌BHI培養(yǎng)基作為空白對照組，以無光敏劑的接種菌液的BHI培養(yǎng)基作為陰性對照組。

光照組、不光照組與陰性對照組各孔分別接種5 μl菌懸液，空白對照組用5μl無菌的BHI液代替，各培養(yǎng)板用錫箔紙包好置厭氧培養(yǎng)箱中避光孵育5 min，以增加細菌對光敏劑的攝取。

取出所有實驗組與對照組，用牙科LED光固化燈分別對光照組每一個加樣孔照射30 s，照射時光固化燈底端距離液面約5 mm。之后將所有實驗組與對照組避光厭氧孵育，變異鏈球菌孵育24 h，嗜酸性乳桿菌和黏性放線菌孵育48 h。

培養(yǎng)結束后，菌液經(jīng)過充分震蕩混勻在暗背景下，肉眼觀察微孔內(nèi)液體清亮無渾濁或無沉淀生長的最低藥物濃度即為該菌的最小抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC）。從清亮的孔中取20μl接種于BHA平板中，放入37℃厭氧孵箱中培養(yǎng)24 h。無細菌生長的最低濃度即為該菌的最小殺菌濃度（minimal bactericide concentration，MBC）。所有實驗組與對照組所有菌種的MIC及MBC測定實驗均重復3次。

1.5 統(tǒng)計學方法

應用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件對各組光敏劑實驗組、非光照組與對照組的MIC、MBC值進行Kruskal-WallisH檢驗，雙側檢驗水準α=0.05。

2 結 果

不同光敏劑在光照及非光照條件下對口腔常見致齲菌的MIC及MBC結果如表1。光敏劑在光照下對常見口腔致齲菌均表現(xiàn)出不同程度的抗菌活性，玫瑰紅、甲苯胺藍、亞甲基藍MIC及MBC較低，其中甲苯胺藍對3種細菌的MIC范圍在6.25～25μmol/L，MBC范圍在12.5～100μmol/L。玫瑰紅對3種細菌的MIC范圍在0.5～2μmol/L，MBC范圍在0.5～4 μmol/L。亞甲基藍對3種細菌的MIC范圍在1.56～25μmol/L，MBC范圍在12.5～100 mol/L。其余光敏劑組：玫瑰紅＞亞甲基藍＞甲苯胺藍＞赤蘚紅＞姜黃素＞核黃素。核黃素對3種致齲菌的MIC：10 mol/L，MBC＞10 mol/L沒有表現(xiàn)出明顯的抗菌性。

各組光敏劑對實驗菌在不進行LED光照情況下。除玫瑰紅組外對實驗菌株的MIC與MBC相比于光照組無顯著差異（P＞0.05）。而玫瑰紅在不進行光照情況下對3種實驗菌株的MIC范圍為1～4μmol/L，MBC范圍為1～8μmol/L。抗菌能力低于光照組。

光固化燈光照30 s可以增強玫瑰紅的抗菌活性，尤其對于嗜酸乳桿菌和黏性放線菌的抗菌活性甚至超過氯己定（P＜0.05），光照組玫瑰紅MIC、MBC低于甲苯胺藍、亞甲基藍（P＜0.05），光動力抗菌作用最強。

表1 不同光敏劑在非光照及光照條件下對口腔常見致齲菌的抗菌活性比較（MIC/MBC）Tab 1 Antimicrobial activity of different photosensitizers against common oral cariogenic bacteria with or without irradiation

3 討 論

齲病患病率在我國一直居高不下［4］。致齲菌是導致齲病發(fā)生的重要因素。對致齲菌的抑制是預防和控制齲病的發(fā)生發(fā)展的有效措施，而光敏劑介導的光動力療法具有顯著的廣譜抗菌作用。本研究選擇了6種常見的小分子光敏劑，以3種口腔常見致齲菌為對象，檢測光敏劑的抗菌作用。其中變異鏈球菌是口腔菌斑形成的促進因素［5］，也是最主要的致齲菌；嗜酸性乳桿菌具有產(chǎn)乳酸能力，與齲損的形成有密切關系；黏性放線菌是構成口腔內(nèi)齦下菌斑的主要細菌，同時參與根面齲的發(fā)生［6］。

光動力療法通過光敏劑產(chǎn)生的單線態(tài)氧與自由基發(fā)揮抗菌作用，其作用效果取決于光敏劑種類、光源的選擇以及光照時間。光敏劑在光化學反應中作為能量的載體是反應過程中最不可或缺的部分。它的性能決定了起到光動力殺菌效應的活性氧族的產(chǎn)率。以往光動力療法的研究多使用特制的激光光源，且照射時間長，本實驗中使用臨床中常用的牙科LED光固化燈作為引發(fā)光動力效應的光源，光照時間僅為30 s，篩選更適于口腔臨床應用的小分子光敏劑。

本實驗中，除外核黃素，幾種光敏劑在不進行光照的情況下均有一定的抗菌能力。核黃素發(fā)揮光動力效應相關研究因應用光氧化交聯(lián)膠原原理治療圓錐角膜而被熟知，但有研究表明核黃素在藍光LED照射下對放線共生放線桿菌、糞腸球菌等也能發(fā)揮光動力抗菌效應［7］。該研究中，雖光照波長在其吸收波長范圍內(nèi)，但因為本實驗采取的光照時間較前人研究［8-9］（1 min至30 min不等）更短（30 s）。實驗結果中未體現(xiàn)出核黃素的光動力抗菌活性。而姜黃素為植物提取物，近年來被報道應用于腫瘤的光動力治療中，能有效抑制宮頸癌細胞的增殖［10］，并有體外實驗研究表明其在藍光LED下照射5 min對唾液內(nèi)的變異鏈球菌具有抑菌性［11］，Mahdi等［12］研究表明甲苯胺藍同赤蘚紅在藍光照射下均有對嗜酸乳桿菌的殺滅作用。該研究中，姜黃素與赤蘚紅在光照或不光照時抗菌能力都較弱并且MIC與MBC未因光照而下降。甲苯胺藍與亞甲基藍作為最早應用于臨床的光動力抗菌藥物，屬于吩噻嗪類，二者均有較高的單線態(tài)氧產(chǎn)率［13］。文獻報道甲苯胺藍具有很高的細菌細胞膜結合率，定位在細胞膜后，經(jīng)過照射能迅速將細菌殺死［14］。Nada等［15］的研究表明甲苯胺藍在LED照射下能有效殺死變異鏈球菌，同時具有一定暗毒性，在未光照情況下，對變異鏈球菌也有一定的抗菌能力，與本研究結果一致。但實驗結果表示，這兩種光敏劑抗菌能力并未因光照而增強。推測可能是因為這幾種光敏劑最敏感的波長范圍并不在實驗所用光源范圍（430～480 nm）內(nèi)，如赤蘚紅為520～530 nm，甲苯胺藍與亞甲基藍為625～635 nm，姜黃素為405 nm［16］，同時有研究表明光動力抗菌效果隨光照功率上升而增強［17］。牙科LED燈波長范圍較激光或特制LED燈更寬，相同光強下，特定波長光的能量相對較低，所以上述幾種光敏劑應用實驗光源并沒有體現(xiàn)明顯的光動力抗菌作用。但牙科LED燈作為光動力療法光源，不僅便于臨床應用，更能避免熱效應對周圍組織的損傷［18］。能在便于臨床應用的條件下短時間內(nèi)發(fā)揮光動力抗菌效應。

雖然幾種光敏劑除核黃素外均具有一定的暗毒性，在齲病防治中能起到一定效果，但評價光敏劑光動力抗菌效果重要的一點是所選用的光敏劑應當在受到光照射時增強光動力抗菌作用。而經(jīng)過光照后，只有玫瑰紅對三種細菌的MIC、MBC較不光照組更低。玫瑰紅是一種氧雜蒽類光敏劑，具有良好的生物安全性，有學者使用牙科光固化燈作為激發(fā)光源，在懸浮的牙齦卟啉單胞菌形成生物膜后進行30 min光照處理，在牙齦卟啉單胞菌死亡的情況下，PDT的作用不會引起成纖維細胞的損傷［19］。本實驗結果不僅表明光照增強了玫瑰紅的抗菌性，而且能在較短的時間內(nèi)發(fā)揮光動力抗菌作用，且抗菌效果明顯優(yōu)于其他各個組，具有較強的光動力抗菌性。但其對齲病的治療效果還需要更多的臨床實驗研究，以期為抑制致齲菌進而控制齲病發(fā)生發(fā)展提供新的思路。

4 結 論

在受試光敏劑中，無論是否光照，玫瑰紅對3種口腔常見致齲菌的抗菌作用均最強，與氯己定相當。牙科LED光固化燈光照30 s可以增強玫瑰紅的抗菌活性，而對其他光敏劑抗菌效果的改變不明顯。玫瑰紅介導的光動力療法具有用于齲病防治的良好前景。