不同采收期江枳實揮發性成分的GC-MS 指紋圖譜

鄧可眾， 陳 虹， 葛 菲， 熊 英*， 危先文

（1.江西中醫藥大學，江西 南昌330004；2.梅州市中醫醫院，廣東 梅州514011）

枳實是常用的理氣類中藥之一，為蕓香科植物酸橙Citrus aurantium L.及其栽培變種或甜橙Citrus sinensis Osbeck 的干燥幼果，市場上藥材來源多以酸橙為主。江西的酸橙植物資源極其豐富，江枳實為贛產道地藥材，每年5 ～6 月收集自落的酸橙幼果入藥。藥材采收期是影響中藥質量的重要因素之一，圍繞枳實所含非揮發性成分如生物堿、黃酮類成分的分析檢測已有較多報道［1-6］。枳實中也含有大量的揮發性成分，通常以檸檬烯的含有量較高［7-9］，并且揮發油、檸檬烯具有促進胃腸道蠕動、抗菌等活性［10-16］。雖對枳實揮發油的GC 指紋圖譜已有相關研究［17］，尚未見采用指紋圖譜對不同采收期枳實中揮發性成分進行動態分析的報道，GC-MS 聯用技術為研究中藥材揮發性成分提供便捷方法，課題組利用GC-MS 建立江枳實揮發性成分的指紋圖譜，對16 批次不同采收期江枳實中揮發性成分進行動態分析，以期為江枳實最佳采收時間的優選提供科學依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器 儀器Agilent7890AGC-Agilent5975CMS聯用儀 （美國Agilent 公司）， 質譜檢索數據庫NIST11.L；XS3DU 電子分析天平（百萬分之一，瑞士Mettler-Toledo 公司）；BS 224S 電子分析天平（萬分之一，德國Sartorius 公司）。

1.2 材料 據產地調查酸橙于5 月中旬開始落花結果，生長至6 月底7 月初時的未成熟果實則作為枳殼藥用，故江枳實的采集時間分別為2014年的5 月21 日、6 月1 日、6 月11 日、6 月21日，經江西中醫藥大學鄧可眾副教授鑒定為蕓香科植物酸橙Citrus aurantium L.的干燥幼果，信息見表1。

檸檬烯（批號H11M6Q1，含有量≥98%） 購于上海源葉生物科技有限公司；正己烷（分析純，西隴化工有限公司）；無水硫酸鈉（分析純，天津風船化學試劑公司）。

2 方法與結果

2.1 溶液制備

2.1.1 對照品溶液 精密稱取檸檬烯對照品溶于正己烷中，配制成質量濃度為94.80 μg／mL 的溶液，即得。

2.1.2 揮發油提取 取枳實粉末（過3 號篩）20 g，加8 倍水，并在揮發油提取器上加2 mL 正己烷，加熱提取5 h，冷卻1 h，收集含揮發油的正己烷層，用1 mL 正己烷潤洗揮發油提取器，合并正己烷溶液，用適量無水硫酸鈉靜置脫水12 h，取出正己烷溶液并定容至10 mL。

2.2 分析條件 Agilent HP-5MS 柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；進樣口溫度250 ℃；進樣量1 μL；分流比1 ∶10；載氣氦氣；程序升溫（初始60 ℃，以2 ℃／min 速率升到80 ℃，再以3 ℃／min速率升到100 ℃，保持1 min，再以5 ℃／min 速率升到180 ℃，保持1 min，最后以6 ℃／min 速率升到260 ℃）；離子源溫度230 ℃；接口溫度280 ℃；四級桿溫度150 ℃；質量掃描范圍m／z 45～550。

2.3 方法學考察

2.3.1 精密度試驗 取同一江枳實樣品（S5），在“2.2” 項條件下連續進樣6 針，檸檬烯（2 號峰） 為參照峰，測得18 個共有峰的相對保留時間與相對峰面積RSD 均小于0.40%。表明儀器精密度良好。

2.3.2 重復性試驗 取同一江枳實樣品6 份（S5），按“2.1” 項下方法制備樣品，在“2.2”項條件下分別進樣，檸檬烯為參照峰，測得18個共有峰的相對保留時間RSD 小于1.17%，相對峰面積RSD 小于3.14%。 表明該方法重復性良好。

2.3.3 穩定性試驗 取同一江枳實樣品（S5），在“2.2” 項條件下， 分別于0、2、4、8、12、24 h 進樣，檸檬烯為參照峰，測得18 個共有峰的相對保留時間RSD 小于0.06%，相對峰面積RSD小于2.92%。表明供試品溶液在24 h 內穩定性良好。

2.4 指紋圖譜建立 4 個產地不同采收期的16批樣品，按“2.1.2” 項下方法制備供試品溶液，在“2.2” 項條件下進樣，所得數據導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2004 A 版，中位數法計算相似度，時間窗0.5，校準后得16 批樣品揮發性成分的GC-MS 指紋圖譜見圖1，對照譜圖見圖2，共檢識得到相對含有量較高的18 個共有特征峰。

2.5 指紋圖譜分析

2.5.1 相似度分析 結果見表1，新干三湖鎮6月上旬及樟樹昌傅鎮5 月下旬采收的S6、S13 號江枳實的相似度分別為0.861、0.875，其余樣品均大于0.9，表明不同采收期江枳實的總體相似度較高；并且來自同一采集地點但不同采收期樣品的相似度均以6 月中下旬的更高，故而從揮發性成分來看，以6 月中下旬采集的江枳藥材質量的均一性相對較好。

表1 16 批樣品相似度Tab.1 Similarities of sixteen batches of samples

圖1 16 批樣品揮發性成分GC-MS 指紋圖譜Fig.1 GC-MS fingerprints of volatile components in sixteen batches of samples

圖2 16 批樣品揮發性成分GC-MS 對照圖譜Fig.2 GC-MS reference spectrum of volatile components in sixteen batches of samples

2.5.2 共有峰分析 根據質譜庫檢索鑒定（匹配度＞90%） 共有峰成分名稱及相關特征參數見表2，其中，包括6 個單萜烯類、6 個倍半萜烯類、4 個單萜醇及2 個酯類成分，16 批樣品中各共有峰的面積歸一化相對百分含有量見表3。所有樣品中均以檸檬烯相對含有量為最高（15.0%～40.0%）、其 次 芳 樟 醇 （8.1% ～25.8%）、 大 根 香 葉 烯（7.9%～15.9%） 的含有量較高。同一采集地4 個不同采收期進行比較，可以明顯看出主成分檸檬烯的相對含有量隨果實生長、成熟度增加呈現上升趨勢，見圖3。

圖3 16 批樣品中檸檬烯相對含有量變化Fig.3 Variation tendency of relative content of limonene in sixteen batches of samples

表2 各樣品中共有的揮發性特征成分Tab.2 Common volatile components of various samples

表3 16 批樣品共有峰成分相對含有量（%）Tab.3 The relative content of common components in sixteen batches of samples（%）

3 討論

對枳實揮發性成分的提取比較了水蒸氣蒸餾提取與溶劑提取法，其中溶劑提取法考察了乙醚和石油醚（30～60 ℃）2 種溶劑以及超聲與回流2 種方法。結果表明超聲與回流提取無明顯差異，提出揮發油的含有量與種類相差不大，乙醚與石油醚的提取率也無明顯差異，水蒸氣蒸餾與溶劑提取法均能獲得低沸點的揮發油，但溶劑提取法可同時提出較多高沸點、非揮發性成分，即便升溫達300 ℃，高沸點化合物仍沒有檢測完全，故而選擇水蒸氣蒸餾提取。因提取后水、油分離不便，故在揮發油提取器上端加入適量正己烷，并考察提取時間3、4、5、6 h 對提取率的影響，進樣分析發現隨著提取時間的延長，各成分含有量逐步增加，5 h 提取率可達6 h 的95%，故選擇5 h。

不同采收期江枳實藥材中所含揮發性成分的種類類似，但在相對含有量上有較大差異。來自同一采集地點、不同采收期江枳實的相似度均以6 月中下旬的更高，且檸檬烯亦以6 月中下旬的相對含有量較高。課題組前期進行了江枳實的UPLC 指紋圖譜研究［18］，不同產地及不同采收期江枳實所含非揮發性成分亦十分相似，含有量以6 月中旬為最高，然而生長至6 月下旬的果實進一步膨大通常產量相對更高，綜合分析兩類成分的動態變化及產量，建議6 月中下旬為最佳采收期。