骨疏康顆粒對去卵巢小鼠體重、血清骨代謝指標和組織形態學的影響

楊駿杰 趙永見 王強 張巖 李晨光 施杞 王擁軍,4 舒冰 趙東峰*

1.上海中醫藥大學附屬龍華醫院，上海 200032 2.上海中醫藥大學脊柱病研究所，上海 200032 3.教育部筋骨理論與治法重點實驗室，上海 200032 4.上海中醫藥大學康復醫學院，上海 201210

絕經后骨質疏松癥(POP)是原發性骨質疏松癥最常見的類型，患者以骨量降低、骨組織結構損壞、骨脆性增加，易發生骨折為特征的全身性骨病[1]。隨著人口老齡化日趨嚴重，POP發病率呈明顯的上升趨勢，給患者、家庭和社會帶來沉重負擔[2]。雌激素缺乏導致骨吸收增強是POP的重要病理改變，因此，降低骨吸收和增加骨生成，恢復骨吸收和骨生成的平衡成為治療POP的重要策略。目前臨床針對POP的治療方案主要體現兩個方面：①通過刺激成骨細胞分化促進骨生成。②通過抑制破骨細胞的骨吸收[3]。但是，目前臨床上現存治療POP的藥物效果存在諸多不足[4]。因此，尋找安全有效、便于長期服用的藥物是醫務工作者面臨的重要挑戰。

中醫藥多遵從“腎主骨”理論指導治療POP，補腎益精法是臨床治療POP重要法則之一，骨疏康顆粒(GSK)是其中具有代表性的方劑。GSK是在中醫“補腎、益氣、壯骨”等理論指導下構建的方劑，前期臨床效果顯著，成為中醫藥治療POP的代表方劑。隨后研究表明GSK能夠抑制骨量丟失[5]，發揮系統調控骨生成和骨吸收的骨保護作用。同時，GSK能夠顯著提高血液中維生素D和鈣的代謝水平[6]，從而增強骨生成。但是GSK在血液中對骨代謝指標的明確藥理學作用尚未闡述。本研究以OVX小鼠為研究對象，闡述GSK治療POP的藥理學代謝作用。

1 材料和方法

1.1 材料準備

骨疏康顆粒(GSK)，國藥準字號：Z20003255，遼寧康辰藥業有限公司，主要成分：淫羊藿、熟地黃、骨碎補(補腎藥物)、黃芪(益氣)、丹參(活血)、木耳、黃瓜子等，遵循中藥補腎、益氣、活血等原理組方而成。按Meeh-Rubner氏公式[7]計算人體表面積為1.8 m2，小鼠體表面積為0.0 067 m2。按人的劑量為20 g骨疏康顆粒/70(kg·d)計算，小鼠的等效劑量約為4 g/(kg·d)。GSK溶于生理鹽水，按照每次0.5 mL每只的劑量灌胃，每天一次連續干預3個月。

鈣爾奇作為陽性對照藥使用。鈣爾奇D碳酸鈣D3片(600 mg+D3 125IU，片劑)，國藥準字H10950029，惠氏制藥有限公司。本實驗中按照臨床劑量進行轉換，鈣爾奇D600。按人的劑量為2片/70(kg·d)計算，小鼠的等效劑量為0.372片/(kg·d)。每只小鼠平均體重30 g。將每片鈣爾奇D溶于44.8 mL生理鹽水，濃度0.2 232 g/mL，每只每次按0.5 mL劑量灌胃，每天一次連續干預3個月。

1.2 動物造模和干預

3月齡雌性C57BL/6小鼠120只，來自SLAC實驗動物公司，飼養于上海中醫藥大學動物實驗中心。隨機分組(20只/組)為：正常組(假手術組，Con)、模型組(OVX)、鈣爾奇對照阻(CA)、GSK低劑量組[GSKL：2 g/(kg·d)]、GSK中劑量組[GSKM：4 g/(kg·d)]和GSK高劑量組[GSKH：8 g/(kg·d)]。動物造模時，采用氯胺酮麻醉，從背部施行雙側卵巢切除術，假手術組僅從背部暴露腹腔，將卵巢暴露，剪去適量脂肪后復位縫合。保溫條件下確保每組至少有16只小鼠存活。術后給予不同劑量GSK灌胃3個月。其中，鈣爾奇對照組[0.223 g/(kg·d)]，正常組和模型組給予等量生理鹽水。實驗結束后，采集標本進行組織學分析。上述實驗方案均經上海中醫藥大學動物保護與使用機構委員會批準(項目批準號：SZY201603007)。

1.3 檢測指標

1.3.1小鼠體重變化情況：小鼠體重能夠從整體水平反映小鼠的健康狀態，也是評價藥物治療POP療效和安全性的常用數據之一，本研究分別在治療期間的1、2和3個月稱量各組小鼠的體重變化情況。

1.3.2血清骨代謝指標：小鼠采用眼球取血方法獲得全血，離心后獲得血清。血清濃縮后按照等比例進行稀釋。從SUSABIO 生物公司購買的ELSA 試劑盒，分別檢測小鼠血清中β-CTX、PINP、ALP、OCN表達水平。按試劑盒標準操作步驟，加入血清后37 ℃震蕩30 min，然后酶標儀于562 nm檢測各組小鼠血清中β-CTX、PINP、ALP和OCN的表達，并進行統計分析。

1.3.3骨組織形態學：小鼠處死后取L5椎體，放入10%福爾馬林過夜，然后流水沖洗2 h，加入4% EDTA脫鈣液進行脫鈣3周。然后用石蠟包埋和切片(5 μm)。樣本切片后，常規脫蠟至水，鹽酸乙醇分化30 s，之后放入Amresco公司的阿爾新藍染色劑(貨號0298)30 min，再次鹽酸乙醇分化5 s后放入Acridine Orange 染色液中15 min，然后封片固定和干燥。分別觀察正常組(Con)、模型組(OVX)、鈣爾奇組(CA)以及GSK的低(GSKL)、中(GSKM)、高(GSKM)3個劑量組小鼠腰椎的骨組織形態。

1.4 統計學處理

實驗驗數據采用SPSS 20.0軟件系統進行統計。結果滿足正態分布、方差性檢驗，組間比較使用單因素方差分析(One-Way ANOVA)，用Dunnett檢驗比較GSK各劑量組、CA組與OVX組差異。上述統計結果，P< 0.05認為差異有統計意義。

2 結果

2.1 GSK對小鼠體重的影響

實驗各組分別在小鼠造模成功后1周內開始灌胃小鼠(0 m)，并測量小鼠的體重。為檢測GSK對小鼠體重影響，我們分別在干預1、2、3個月內，稱量各組小鼠的體重變化。結果顯示OVX組小鼠體重出現的增加(P<0.05),這與前面研究的發現吻合，其原因可能是去除卵巢后導致小鼠基礎代謝率下降，因此對小鼠體重有刺激作用[8]。同時，在GSK干預的1、2和3月內，GSK干預各組小鼠之間的體重與OVX組體重有所下降，統計結果顯示只有中劑量組(GSKM)觀察到統計意義(P<0.05)，低劑量組和高劑量組未觀察到統計意義(P>0.05)。

表1 GSK對小鼠體重的影響Table 1 Effect of GSK granule on the body weight of mice

注：0 m 造模成功后1周內的體重；1 m GSK灌胃1個月各組小鼠體重的變化；2 m GSK灌胃2個月各組小鼠體重的變化；3 m GSK灌胃3個月各組小鼠體重的變化。與正常組比較，*P< 0.05，與模型組比較，#P< 0.05。

2.2 血清骨代謝指標

采集外周血液后，檢測各組小鼠血清中β-CTX、PINP、ALP、OCN等骨生成指標的表達水平(圖1)。研究結果發現OVX組3月時小鼠血清中骨生成指標與對照組相比，ALP(圖2 A)和OCN(圖2B)的表達有顯著升高(P< 0.05)，而PINP(圖2C)的表達下降(P< 0.05)。GSK干預后，骨生成指標PINP下降趨勢減緩，而ALP和OCN的表達繼續維持在較高水平。骨吸收指標方面，OVX組3月時骨吸收的β-CTX(圖2D)指標升高(P< 0.05)，GSK干預后，β-CTX表達下降。血清學的研究表明GSK干預能夠在總體水平上刺激骨生成相關指標PINP、ALP、OCN的表達，同時降低骨吸收指標β-CTX的表達，從而發揮系統調控骨生成和骨吸收的作用。

圖1 GSK對小鼠血清中骨代謝ALP、OCN、PINP和β-CTX的影響(A)GSK刺激小鼠血清中ALP的表達。(B)GSK刺激小鼠血清中OCN的表達。(C)GSK刺激小鼠血清中PINP的表達。(D) GSK降低小鼠血清中β-CTX的表達。與正常組比較，*P < 0.05；與模型組比較，#P < 0.05。Fig.1 Effect of GSK granule on the serum expression of bone metabolic parameters ALP, OCN, PINP, and β-CTX

2.3 骨組織形態學檢測

小鼠腰椎取材后，采用阿爾新藍染色觀察GSK對小鼠骨結構的作用。研究結果發現，去卵巢3月后，小鼠出現骨量丟失的表型，具體體現在小鼠腰椎的骨小梁數目較少、結構疏松、間隙變大(圖2)。GSK干預后，小鼠骨量丟失得到緩解。上述研究表明，GSK干預后OVX小鼠骨量丟失的表型得到緩解，從而發揮了延緩去卵巢誘導的骨丟失的療效。

圖2 GSK對小鼠腰椎骨結構變化Fig.2 Effect of GSK granule on bone structure in the lumber vertebrae

3 討論

本研究通過測量動物體重、血清骨代謝指標和組織形態等手段，證明GSK干預OVX小鼠模型骨量丟失的保護作用。同時在血液代謝水平能夠降低骨吸收過程中β-CTX 的表達，同時刺激骨生成相關指標PINP、ALP、OCN的表達。并在組織學加以驗證。綜上所述，本研究提示GSK的兩方面作用：一方面，能刺激成骨細胞的骨生成，提高PINP、ALP、OCN的表達水平。另一方面，抑制破骨細胞的骨吸收，降低β-CTX的表達。因此，本研究部分闡述了GSK發揮治療POP的藥物學作用，也為后期機制研究奠定基礎。

OVX模型是目前較為公認的POP動物模型[9]，常用于POP治療和預防的藥物開發的藥理、藥效等實驗。早在20世紀40年代Albright就提出POP的病理改變[10]：發現雌激素水平下降與POP的發病有密切的相關性。隨后，研究發現雌激素可直接作用于成骨細胞和破骨細胞的雌激素受體，限制骨代謝中的骨轉換[11]，延緩骨量丟失發揮骨保護作用。目前治療POP的方法是一方面通過刺激成骨細胞分化促進骨生成，另外一個方面是抑制破骨細胞的骨吸收。但是目前臨床常用的藥物雖取得一定療效，但是存在諸多不良反應。中醫藥已被證實是一種有效治療POP替代藥物，其優勢是能夠同時增加骨生成和抑制骨吸收，從而延緩骨量丟失，改善POP患者的骨質疏松病變[12]。隨著現代醫學的發展，利用中醫藥治療骨質疏松癥，著重調整機體整體功能，已成為一種趨勢。

POP屬于現代醫學的病名，該病在歷代中醫文獻中未見有明確的記載，但是根據其癥狀應該屬于中醫“腰痛”、“骨枯”、“骨燒”、“骨痿”、“虛勞”等疾病的范疇。POP發病的癥狀與“骨痿”病因、病機最為相似。其病因病機主要有腎精虧虛、脾胃虛弱、肝失調達、瘀血阻絡等[13-14]。其中腎精虧虛是最為核心的病理基礎，補腎益精法是治療POP的一個重要法則。前期研究發現GSK治療POP的作用原理是補腎益氣、活血達到壯骨的目的[15]。其組成淫羊藿、熟地黃、骨碎補能益精填髓、補益肝腎，是為君藥；黃芪、丹參益氣活血，輔助配合補腎藥物的補益作用，是臣藥；木耳、黃瓜子補腎益氣，活血壯骨，為佐使之藥。因此，上述諸藥配合主要治療腎虛、氣血不足所致包括POP在內的中老年骨質疏松癥，適用于伴有腰脊酸痛、足膝酸軟、神疲乏力等腎虛癥狀的患者。

本研究從小鼠體重檢測結果可見，GSK干預的1、2、3月內OVX小鼠體重的出現下降，提示GSK干預后對OVX小鼠體重有所降低，從而佐證本實驗設計的藥物劑量未造成明顯的毒性，藥物的劑量選擇是在安全劑量的范圍內。血清骨代謝指標檢測發現 GSK干預3月內能夠增加去卵巢血清中ALP、OCN和PINP的表達，增加成骨細胞的活性。ALP、OCN是參與成骨細胞分化的的重要調控因子，他們與PINP都是反映成骨細胞骨生成的主要指標[16]。同時，補鈣是臨床治療POP的常見基礎方法，因此，本課題使用鈣爾奇(CA)作為POP的基礎用藥和平行對照藥物，證明GSK的療效的確切性。但是，本課題目的是明確GSK的治療效果，鈣爾奇僅作為陽性參照，雖然鈣爾奇與OVX組相比，也能提高血清中ALP、OCN和PINP的表達，但是其僅僅是作為陽性對照，而未涉及GSK與鈣爾奇療效的比較作用，未來研究可能涉及此作用。另外，GSK在調控破骨細胞分化方面的表現在能抑制OVX小鼠破骨活性指標β-CTX的高表達，從而抑制骨吸收。β-CTX是破骨細胞骨吸收溶解Ⅰ型膠原的進一步分解產物，通過檢測血清β-CTX的水平對于早期診斷POP，評估骨量減少程度具有重要意義[17]。上述血清學作用通過骨組織形態學檢測得以證明：GSK的低、中、高劑量干預能夠延緩OVX造成的骨量丟失，其機制與其刺激骨生成和抑制骨吸收的作用相關。

綜上所述，本實驗通OVX小鼠體重、血清骨代謝指標和組織形態的研究證明GSK顆粒能刺激成骨細胞的骨生成和抑制破骨細胞的骨吸收，發揮系統調控的作用。該研究為后續治療POP相關藥物的開發奠定了一定的研究基礎，同時也拓寬了臨床治療POP藥物選擇的范圍。