千果欖仁及小葉欖仁核型分析

余 瀟，辛培堯，尹亞梅，楊自云，鄧莉蘭

(1.西南林業大學園林學院，云南 昆明 650224； 2.國家林業局西南風景園林工程研究中心，云南 昆明 650224； 3.西南林業大學林學院，云南 昆明 650224； 4.西南山地森林資源保育與利用教育部重點實驗室，云南 昆明 650224)

千果欖仁(Terminaliamyriocarpa)和小葉欖仁(Terminalianeotaliala)均為使君子科(Combretaceae)訶子屬(Terminalia)植物。千果欖仁在我國主要分布于廣西(龍津)、云南(中部至南部)和西藏(墨脫)，是我國二級重點保護野生植物，按IUCN地方瀕危等級標準評價屬于“瀕危種(EN)”[1]。小葉欖仁原產非洲的馬達加斯加，我國的云南、廣西、廣東、福建、臺灣等熱帶地區已有栽培。對欖仁屬植物的染色體核型的研究目前尚處于空白狀態，開展其研究一方面可為2種植物的育種研究提供參考，另一方面也可為屬間和種間的進化關系以及生物的系統發育研究提供參考[2]。

1 材料和方法

1.1 材料

本實驗所需千果欖仁種子來自于云南省鎮沅縣境內的哀牢山國家級自然保護區及瑞麗市境內的銅璧關自然保護區，小葉欖仁種子來自于云南省鎮沅縣。種子采收去除雜質后在西南林業大學園林學院云南省園林植物與觀賞園藝重點實驗室進行育苗。

1.2 方法

染色體制片技術采用李懋學等[3-4]提出的方法。

1.2.1 取樣 待千果欖仁和小葉欖仁幼根長至1～1.5 cm時，于9∶00—10∶00時進行取材，選擇生長健壯的白色根尖。

1.2.2 預處理 千果欖仁預處理：預處理試劑為飽和對二氯苯溶液，將根尖浸泡在飽和對二氯苯溶液，置于4 ℃冰箱中1.5 h。 小葉欖仁預處理：預處理試劑為飽和對二氯苯溶液，將根尖浸泡在飽和對二氯苯溶液，置于4 ℃冰箱中1 h。

1.2.3 固定 千果欖仁固定：將經過預處理后的根尖取出轉入卡諾氏固定液(無水乙醇∶冰醋酸=3∶1，現配)，放入4 ℃冰箱中固定45 min。小葉欖仁固定：將經過預處理后的根尖取出轉入卡諾氏固定液(無水乙醇∶冰醋酸=3∶1，現配)，放入4 ℃冰箱中固定30 min。

1.2.4 解離 千果欖仁解離：取出固定好的根尖，放入蒸餾水中浸泡10 min，解離液用1 mol·L-1鹽酸和45%醋酸按1∶1比例在60 ℃水浴鍋中預熱6 min，將根尖放入解離液中解離15 min，取出用蒸餾水多次沖洗[5-9]，洗除材料殘留的解離液。小葉欖仁解離：取出固定好的根尖，放入蒸餾水中浸泡10 min，解離液用1 N鹽酸在60 ℃水浴鍋中預熱6 min，將根尖放入解離液中解離10 min，取出用蒸餾水多次沖洗，洗除材料殘留的解離液。

1.2.5 染色制片 將解離好的根尖置于潔凈的載玻片中央，用刀片切下0.1 cm左右的呈透明狀的根尖，滴加1～2滴醋酸地衣紅染液進行染色2 min左右，用濾紙吸取多余染液，迅速蓋上蓋玻片，然后小木棍輕輕敲打蓋玻片，使細胞分散和展開[5]。

1.2.6 鏡檢 用日本OlympusBX51顯微鏡進行觀察，選取50個細胞染色體分散均勻、分裂相較好、染色體完整、著絲點及輪廓清晰、各條染色體處于同一平面的中期細胞，并進行顯微照相測量及統計。

本實驗染色體核型分析采用Levana等[10-11]標準劃分，核型類型根據Stebbins[12]的研究依據劃分，植物染色體標準化分析采用李懋學等[13]方法。使用OPTPRO2008數碼顯微鏡圖像分析處理系統中的測量工具測量染色體長度。

2 結果與分析

通過對千果欖仁和小葉欖仁染色體數目進行觀察和統計，確定兩者的染色體數目均為24條，未發現非整倍性變異，因此可以確定千果欖仁和小葉欖仁體細胞染色體數目為2n=2x=24，基數為x=12的二倍體(表1、圖1、圖2)。

表1 千果欖仁和小葉欖仁染色體參數

表1(續)

*：表中染色體相對長度系數(I、R、L)根據染色體長度/全組染色體平均長度的比值判斷，其標準為：I、R、L<0.76，短染色體(S)；0.76126，長染色體(L)。根據臂比值大小，可將染色體分為4種類型：1.0<臂比值≤1.70，中部著絲粒染色體(M)；1.71<臂比值≤3.00，亞中部著絲粒染色體(SM)；3.01<臂比值≤7.00，亞端部著絲粒染色體(ST)；7.01<臂比值≤∞，端部著絲粒染色體(T)。

千果欖仁的染色體相對長度范圍在6.04～10.80 μm，全組染色體平均相對長度為8.3325 μm。最長染色體與最短染色體之比是1.79∶1，染色體相對長度系數范圍為0.72～1.30，按Kuo等[14]的方法，1號為長染色體(L)，2～6號為中長染色體(M2)，7～11號為中短染色體(M1)，12號為短染色體(S)，故千果欖仁的相對長度組成為2n=2L+10M2+10M1+2S。著絲點位置與臂比值方面，臂比范圍在1.11～2.04，平均臂比為1.48，著絲點指數范圍在32.95%～47.31%，9號、11號、12號染色體的臂比為近中部著絲點染色體(sm)，臂比值變化范圍為1.72～2.04，其余為中部著絲點染色體(m)，臂比值變化范圍為1.11～1.44，都在1.01～1.70的范圍內，所以千果欖仁的核型公式為2n=2x=24=18m+6sm，未發現具有隨體染色體。千果欖仁染色體組染色體總長為99.99 μm，長臂總長為58.82 μm，根據Arano[15]的計算方法，核型不對稱系數(AS.K%)為58.83%。千果欖仁的臂比值除12號染色體在2～4范圍內，占染色體總數的8.33%，其余均小于2，核型屬于“2A”型。根據千果欖仁染色體的長短和形態特征進行同源染色體配對，得到染色體核型圖(圖1)。根據表1中所列各染色體的相對長度平均值，用Excel 2007制作繪制核型模式圖(圖2)。

小葉欖仁的染色體相對長度范圍在6.66～10.25 μm，全組染色體平均相對長度為8.335 μm。最長染色體與最短染色體之比是1.54∶1，染色體相對長度系數范圍為0.80～1.23，按Kuo等[14]的方法，1～6號為中長染色體(M2)，7～12號為中短染色體(M1)，故小葉欖仁的相對長度組成為2n=12M2+12M1。著絲點位置與臂比值方面，臂比范圍在1.38～1.69，平均臂比為1.45，著絲點指數范圍在37.18%～41.92%，除7號為近中部著絲點染色體(sm)，臂比值為1.69，其余均為中部著絲點染色體(m)，臂比值變化范圍為1.38～1.48，都在1.01～1.70的范圍內，所以小葉欖仁的核型公式為2n=2x=24=22m+2sm，未發現具有隨體染色體。小葉欖仁染色體組染色體總長為100.02 μm，長臂總長為59.15 μm，根據Arano[16]的計算方法，核型不對稱系數(AS.K%)為59.14%。小葉欖仁的所有染色體臂比值均小于2的，核型屬于“1A”型。根據小葉欖仁染色體的長短和形態特征進行同源染色體配對，得到染色體核型圖(圖1)。根據表1中所列各染色體的相對長度平均值，用Excel 2007制作繪制核型模式圖(圖2)。

圖1 千果欖仁和小葉欖仁中期染色體形態及其核型圖

圖2 千果欖仁和小葉欖仁核型模式圖

3 結論與討論

關于千果欖仁根尖細胞(RTC)進行染色體試驗觀察，關鍵是要獲得分散較好的中期細胞。本試驗在根尖預處理過程中對飽和對二氯苯、秋水仙素、8-羥基奎啉溶液的預處理效果做了比較，發現使用飽和對二氯苯預處理千果欖仁根尖，獲得了分散良好、完整的中期染色體分裂相，效果好于其它2種預處理液。究其原因，主要是因為對二氯苯作用于大染色體的植物比處理小染色體植物的分裂相效果更好[8]。秋水仙素的預處理效果常受其濃度及處理溫度的影響。而在解離過程中，解離時間也是能否獲得滿意的分裂相的關鍵之一，對于千果欖仁根尖細胞的處理時間應控制在6 min左右，具體的準確時間還需要根據試驗條件微調，解離時間如果過短，細胞壁沒有被打破，導致無法觀察；解離時間如果過長，則會導致細胞過于松散甚至破碎，從而導致染色體過于分散無法確定這些染色體是否屬于同一細胞。

在千果欖仁的核型分析中，沒有發現隨體染色體，其原因可能是在預處理過程中次縊痕區或者是核仁組織區的染色體高度濃縮導致與長短臂粘合而導致次縊痕消失[16]，從而導致在試驗中沒有發現染色體隨體，也有可能是由于千果欖仁染色體根本就沒有帶隨體的特征。千果欖仁染色體有無隨體的問題還有待進一步觀察研究。