基于拔尖人才培養的生物化學綜合性實驗設計

趙玉紅, 張 偉, 戴若辰, 馬銘陽, 魏奇瀾,蔣沛恩, 孫雨萱, 李 欣, 趙立青

(南開大學 生物國家級實驗教學示范中心，天津 300071)

0 引 言

2009年，我校入選教育部第一批“基礎學科拔尖學生培養試驗計劃”，成立伯苓班。作為生物學科拔尖人才培養試點班的生物伯苓班，每年經嚴格選拔，招生約25人。生物學是實驗性很強的學科，因此學生科研能力的訓練是拔尖學生培養的重要環節[1]。

生物化學實驗作為生物學實驗類專業課程的先導課，是學生從事其他生命科學研究的重要基礎[2-3]。為在生物化學實驗教學中培養伯苓班學生的科研能力，進一步激發他們的創新潛能，在小班授課、單人操作的基礎上，通過教學-科研相結合的方式，由科研實驗室提供部分具有探究性質的課題內容，作為綜合性實驗項目，面向伯苓班同學開放選修。

蛋白質是一種重要的生物大分子，解析其三維結構有利于闡述其功能。為了研究某蛋白的三維結構，某科研實驗室將目的蛋白基因進行外源高效表達，經純化獲得高濃度、高純度的目的蛋白，然后篩選合適的目的蛋白晶體，對其進行結構解析。但在具體實驗過程中，發現蛋白晶體質量不高。高純度、高濃度的蛋白樣品是獲得高質量蛋白晶體的重要前提，考慮到在使用原核表達系統表達重組融合蛋白時，不同的誘導條件對于蛋白的表達影響很大，優化誘導表達條件十分必要[4]，因此在生物化學實驗教學中，設計“目的蛋白最佳誘導表達條件的確定及其純化”綜合性實驗項目，對伯苓班學生進行科研訓練，旨在提高學生科研能力，取得了很好的教學效果。

1 實驗儀器

AKTA prime plus蛋白純化系統、Amicon濃縮桶、nanodrop 2000超微量紫外分光光度計、超低溫培養箱、恒溫搖床、凝膠成像儀等。

2 實驗材料與試劑

實驗材料：大腸桿菌BL21(DE3)(含某重組蛋白，由科研實驗室提供)。

試劑：Tris，咪唑，NaCl，SDS，甘氨酸，TEMED，AP，考馬斯亮藍R250，低分子量蛋白Marker，冰乙酸，IPTG，氨芐青霉素等。

預裝柱：鎳柱(HisTrapTMHP)，凝膠過濾層析柱(HiPrepTM16/60 SephacrylTMS-200 HR)，離子交換柱(HiTrapTMDEAE FF)。

3 實驗方法

3.1 目的蛋白最佳誘導表達條件的確定

(1) 菌種的培養。將含目的蛋白的大腸桿菌BL21(DE3)誘導活化，以1%的接菌量接種于50 mL LB(含100 μg/mL Amp)培養基中，繼續擴大培養，作為測定目的蛋白最佳誘導表達條件的實驗用菌種。

(2) 目的蛋白誘導表達。將上述實驗用菌種，以1%的接菌量，分別接種于9瓶100 mL LB培養基，37 ℃ ，200 r/min，培養至OD值在0.6～0.8之間。分別添加IPTG，至終濃度分別為100、300、500 μmol/L。分別以16、28、37 ℃振蕩培養，于不同時間取樣500 μL，12 000 r/min，離心1 min，棄上清，-20 ℃凍存。其中16 ℃和28 ℃培養的取樣時間為：8、10、12、13.5、14、20、22 h；37 ℃培養的取樣時間為：3、4、5、6、7 h。誘導前設不加IPTG的陰性對照。

(3) SDS-PAGE電泳檢測。將菌體沉淀用200 μL buffer(50 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L NaCl，5%甘油，pH 8.0)充分懸浮后，加入等體積的2×蛋白loading，混勻，煮沸5 min。12 000 r/min，離心5 min，取樣15 μL，以5%濃縮膠和12%分離膠進行SDS-PAGE電泳檢測，確定目的蛋白最佳誘導表達條件。

3.2 目的蛋白誘導表達及其純化

3.2.1 目的蛋白誘導表達

按3.1(1)對菌種進行活化、擴大培養，以1%接菌量接種到1 L的LB培養基中，以最佳誘導條件對目的蛋白進行誘導表達。4 ℃，8 000 r/min，離心10 min，收集菌體，-20 ℃凍存。

3.2.2 菌體超聲破碎

用40 mL Ni柱結合緩沖液buffer A(50 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L NaCl，5%甘油，pH8.0)充分懸浮菌體沉淀后，菌懸液冰上預冷，超聲破碎。程序：功率180 W，超聲5 s，間歇6 s，直至菌液清亮。超聲破碎后，4 ℃，13 000 r/min，離心40 min，收集上清，作為蛋白樣品粗提液。

3.2.3 目的蛋白純化

(1) Ni親和層析。用Ni親和層析柱對蛋白樣品粗提液進行初步純化。程序：① buffer A平衡His TrapTMHP柱至基線平穩；② B泵上樣，buffer A沖洗Ni柱至UV值不再變化；③ 用洗脫緩沖液buffer B(50 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L NaCl，5%甘油，1 mol/L咪唑，pH 8.0)和buffer A形成咪唑梯度(180 mL，B：0%～30%)，洗脫目的蛋白。2 mL/管收集洗脫液，SDS-PAGE電泳檢測。收集目的蛋白液，濃縮桶濃縮至約1 mL。

(2) 離子交換層析。將濃縮的樣品以1∶100的比例用buffer A(50 mmol/L Tris-HCl，pH8.0)進行稀釋，進一步經陰離子交換柱進行純化。程序：① buffer A平衡HiTrapTMDEAE FF柱至基線平穩；② B泵上樣，buffer A沖洗直至UV值不再變化；③ 用洗脫緩沖液buffer B(50 mmol/L Tris-HCl，1 mol/L NaCl， pH 8.0)和buffer A形成鹽離子梯度(60 mL，B：0～100%)，洗脫目的蛋白。1 mL/管收集洗脫液，SDS-PAGE電泳檢測。收集目的蛋白液，濃縮桶濃縮至5 mL以下。

(3) 凝膠過濾層析。濃縮后的樣品進一步經凝膠過濾層析純化。流動相：buffer A(50 mmol/L Tris-HCl，pH8.0)、buffer B(50 mmol/L Tris-HCl，1 mol/L NaCl，pH 8.0)。程序：① 以15%buffer B平衡HiPrepTM16/60 SephacrylTMS-200 HR一個柱體積；② 15%buffer B洗脫。1.5 mL/管收集洗脫液，SDS-PAGE電泳檢測。收集目的蛋白液。

3.2.4 蛋白濃度檢測

將純化好的目的蛋白液濃縮至1～2 mL，用nano drop 2000超微量分光光度計檢測蛋白濃度，分裝，-80 ℃凍存。

4 結果與分析

4.1 蛋白最佳誘導表達條件的篩選

分別對IPTG不同誘導濃度、不同誘導溫度、不同誘導時間培養的菌種取樣，進行SDS-PAGE電泳檢測(見圖1)。實驗結果表明，在加入IPTG作為誘導劑時，蛋白Marker 43kDa下方產生1條特異性蛋白條帶，與目的蛋白大小(41 kDa)相一致。由于不同的膠染色、脫色程度不同，難以準確判斷蛋白最佳誘導表達條件。為進一步提高實驗結果的可靠性，將圖1中8塊膠上蛋白表達量相對較高的幾個樣品，再次進行SDS-PAGE電泳檢測(見圖2)。結果表明，目的蛋白最佳誘導表達條件為：誘導溫度16 ℃，IPTG濃度300 mmol/L，誘導時間20 h。

(a),(b),(c)：溫度為16 ℃條件下，IPTG濃度分別為100、300、500 mmol/L，誘導時間分別為8、10、12、13.5、20、22 h時的目的蛋白表達; (d),(e),(f)：溫度為28 ℃條件下，IPTG濃度分別為100、300、500 mmol/L，誘導時間分別為8、10、12、13.5、20、22 h時的目的蛋白表達; (g),(h)：溫度為37 ℃條件下，IPTG濃度分別為100、300、500 mmol/L，誘導時間分別為3、4、5、6、7 h時的目的蛋白表達

圖1 IPTG不同誘導溫度、不同誘導時間、不同誘導濃度條件下目的蛋白的表達

圖2 篩選出15種不同IPTG誘導條件下目的蛋白的表達

4.2 Ni親和層析及SDS-PAGE檢測

目的蛋白N端帶有His標簽，能特異性的結合在Ni柱上。用不同濃度的咪唑緩沖液進行洗脫，由于不同蛋白及雜質結合能力不同，因此通過此步可以獲得初步純化的目的蛋白。根據監測圖(見圖3)，紫外吸收從48管開始有升高跡象，在第51、52、53管達到峰值，到55管恢復到基線。于是對48、50、52、54和55管中的蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳檢測(見圖4)。實驗結果表明，鎳柱親和純化效果較好，目的蛋白樣品中存在少許雜蛋白；通過與Marker比較，目的蛋白分子量大小約為41 kDa，與理論值相符；第50～55管中的目的蛋白比較富集且純度較高，收集這6管蛋白，濃縮至1 mL，待進一步純化處理。

圖3 Ni親和層析監測圖

圖4 Ni柱親和層析純化得到的目的蛋白SDS-PAGE電泳結果

4.3 離子交換層析及SDS-PAGE檢測

目的蛋白的等電點為5.03，在pH為8.0的緩沖液中帶負電荷，故選用陰離子交換柱。根據監測圖(見圖5)，對32～38管中的蛋白樣品進行濃縮，體積不大于5 mL。此步操作，由于學生時間關系，簡化了SDS-PAGE電泳檢測。實際上不應該省略此步，因為根據SDS-PAGE電泳檢測結果進行蛋白樣品收集，收集到的蛋白樣品更加富集、純度高，后續純化效果更佳。

圖5 陰離子交換層析監測圖

4.4 凝膠過濾層析及SDS-PAGE檢測

將上述濃縮的蛋白樣品進一步經凝膠過濾層析純化，從監測圖(見圖6)可以看出，出現兩個紫外吸收峰。從出峰時間和峰面積大致判斷后面的主峰應該是目的蛋白峰，前面的小峰可能是分子量較大的雜蛋白。取35、37、39、41和43管進行SDS-PAGE電泳檢測(見圖7)。結果顯示，目的蛋白樣品純度很高，達到了分離純化的目的。

圖6 凝膠過濾層析監測圖

圖7 凝膠過濾層析純化得到的目的蛋白SDS-PAGE電泳結果

4.5 蛋白濃縮及濃度檢測

取凝膠過濾層析39、40、41這3個收集管中的蛋白樣品，濃縮至約400 μL，用nano drop 2000檢測蛋白濃度，濃度為54 mg/mL，表明1 L大腸桿菌最終得到了約21.6 mg的高純度目的蛋白。

5 教學組織

(1) 實驗進度安排。由于伯苓班同學在大二上半學期剛接觸到生物化學基礎理論知識和實驗技能的學習，因此該綜合性實驗的開展安排在實驗課中后期。此時學生理論課上學習了蛋白質、核酸等基本理論，實驗課上學習了SDS-PAGE電泳、凝膠過濾層析、離心、分光光度等技術，具備了一定的生物化學基本理論和操作技能。作為基礎實驗課的一種拓展和提升，該綜合性實驗具有一定的探究性，需要學生付出一定的時間和精力進行鉆研，因此安排實驗課中后期約6周時間，學生可以充分利用業余時間或實驗課上等待間隙，通過查閱文獻資料或與教師探討，了解實驗目的和意義、提出解決方案、自主實驗、完成成果展示等。

(2) 項目為開放性選修項目。為尊重伯苓班同學的個性化發展和學術志趣，與科研實驗室緊密合作，開發了多項符合學生認知水平和操作能力的、具有一定探究性質的綜合性實驗項目，本項目只是其中之一。學生可根據自身興趣，自由選題。為保證教學效果，項目人數控制在4或5人。學生以團隊形式，自主制定實驗計劃和進度安排[5]，應用既有知識和技能解決實際問題。實驗室則為學生積極營造鼓勵獨立思考、自由探索、勇于創新的開放式教學環境[6]。

(3) 研討課。最后一次實驗課結束后，進行綜合性實驗PPT展示。目的有兩個：① 通過PPT制作，促進學生對實驗進行分析、總結和反思，通過理論知識與實踐知識相互融合，使學生對所學知識有著更加透徹的認知和理解[7]，并通過觸類旁通，形成自己的知識體系；② 通過PPT展示，培養學生交流和表達能力，使學生能夠清晰、科學地描述問題，準確表達觀點，初步掌握學術交流能力[8]。且在研討過程中，鍛煉學生推理、應變、思辨的能力，提高綜合素質。

6 教學效果

6.1 激發學生科研興趣

該綜合實驗項目兼具兩大優點：

(1) 實用性。學生需要利用已有的生物化學理論知識和實驗技能儲備，通過查閱相關文獻資料，為科研實驗室課題組獲得高濃度、高純度的蛋白樣品提供可靠的最佳誘導條件。能夠靈活運用所學知識幫助科研實驗室解決實際問題，讓學生很有成就感，大大激發了他們參與科研的興趣。

(2) 挑戰性。由于生物大分子樣品需要95%或更高的純度才易結晶，樣品中的任何雜質都可能與大分子發生作用，影響晶體的生成[9]，因此要獲得滿足要求的、高質量的蛋白樣品，對學生來講，充滿挑戰。對于不愿意按部就班的伯苓班同學來講，該項目充滿吸引力，學生興趣濃厚，整個實驗過程中參與的積極性非常高。同時，該項目組同學的參與，也給其他同學帶來了一定的“攀比壓力”，伯苓班同學紛紛主動走進科研實驗室，整個班級科研氛圍濃厚。

6.2 培養學生科研能力

(1) 培養學生自學能力。由于項目來自于科研課題，實驗開展過程中，沒有教師的講授、沒有可參考的教材，學生必須通過自己查閱相關的文獻資料或與教師探討，才能對實驗原理、實驗設計思路和方法有比較深入、透徹的理解，這需要學生有較強的自學能力。且在不斷地以理論指導實踐，以實踐檢驗理論的實驗實踐中，學生通過對知識不斷進行歸納、總結、分析，自主建構知識體系的能力也得到培養。

(2) 掌握多項實驗技能。本文的實驗結果全部來自學生的實驗結果，通過這些結果，發現學生實踐動手能力尚存在一定的欠缺。通過該綜合性實驗，學生擁有了更多操作、實踐的機會，譬如通過鍛煉，學生的SDS-PAGE操作基本功越來越扎實。同時，學生通過實驗，也學到了很多其他實驗技能，如：無菌操作、蛋白誘導表達以及蛋白純化系統里涉及的多項層析技術等。這些技能的獲得，將有利于他們在科研實驗室自主開展相關的課題研究，擺脫以往只能給師兄、師姐洗瓶子等打下手的窘境。

(3) 培養學生的創新意識。在該綜合實驗的實施過程中，遇到了很多實際問題。譬如對IPTG不同誘導溫度、不同誘導濃度、不同誘導時間的菌體取樣后，樣品處理起初是菌體沉淀用50 μL buffer懸浮后，加入等體積的2×Protein SDS PAGE Loading Buffer，煮沸5 min。結果發現煮沸后的溶液太過黏稠，導致SDS-PAGE的上樣量誤差很大，結果不可靠。后來學生提出改進意見：① 加大體系的量；② 上樣前進行離心。后經學生自己實驗探索，效果很好，在后續實驗中采用了學生改進的方法。整個實驗圍繞“獲得高純度、高得率的目的蛋白”展開，在解決實際問題的過程中，學生發現問題、分析問題、解決問題的能力得到不斷鍛煉。而問題解決的過程本就是一種創新，學生不斷解決問題的過程就是創新意識培養的過程[10]。

(4) 啟發學生思考，形成批判性思維。在PPT制作過程中，學生會對實驗原理進行深究、對實驗結果會進行深入的分析與討論、對實驗的整體設計思路進行回顧與總結，這無形中達到了啟發學生思考的目的。此外，PPT展示結束，學生間、老師和學生間的問答，更是大大促進了學生思考和批判性思維的形成。譬如其他同學提問的問題有：① 初次養菌，發現疑似噬菌體感染，如何發現的？怎么解決菌種問題？② 從實驗結果看，并不是IPTG濃度越高，蛋白誘導表達量越高，為什么？③ 不同的SDS-PAGE膠由于染色、脫色程度不一樣，如何對不同的取樣蛋白樣品進行量化比較，從而選出最佳誘導條件？④ 應用蛋白純化系統進行蛋白純化時，為什么要對收集的蛋白樣品進行濃縮，然后再進行下一步純化？一個個問題的提出，點燃了同學間思想火花的碰撞，潛移默化中孕育創新的種子。

6.3 培養學生團隊合作精神

為提高伯苓班實驗課的教學效果，在授課方式上采取單人操作的方式，賦予學生更多自主探索的實踐機會、便于師生互動，這也是目前拔尖人才培養實驗教學中普遍采用的一種教學方式[11-13]。但是許多創新成果往往需要團隊合作才能產生，因而也不可忽視學生團隊合作意識、溝通能力以及組織能力的鍛煉與培養。本文提出的綜合性實驗項目，需要伯苓班同學以小團隊的形式，來完成實驗目標。團隊不指定負責人，形成“人人參與，人人負責”的團隊運行模式。這對心氣高的伯苓班同學來講，如何以團隊的力量來圓滿完成這樣一項具有自主、合作、探究性質的實驗項目也是一種挑戰。而實驗項目有計劃、有步驟的順利進行,包括以團隊形式進行的PPT展示，表明學生在分工合作過程中對團隊合作精神有了重新的認識，溝通能力、組織能力也得到了很好的鍛煉。

7 結 語

通過教學-科研緊密結合，課程組為學生設計了“目的蛋白最佳誘導表達條件的確定及其純化”這個綜合性實驗項目，旨在教學實踐中滲入科研的內容和方式，充分利用研究項目等科研資源來提高本科教育質量，促進學生的綜合運用和創新能力[14]，并使學生實現自主學習并獲得研究素質和能力[15]。經2016級伯苓班25位同學的實施，取得了很好的教學效果，同學們給予了高度評價。該綜合性實驗項目既體現學科發展前沿，又涉及多項生物化學基礎實驗知識和技能的綜合運用，且具有一定的探究性和挑戰性，適于作為訓練拔尖人才科研能力的生物化學綜合性實驗項目，進行推廣。同時，以科學研究促進教學進步，對于拔尖人才創新能力培養是一個很好的思路，值得借鑒和思考。