淺談不同甲酯化條件對(duì)牛乳中EPA、DHA含量測(cè)定影響

張加永 魏勝記 紀(jì)小蘭

摘 要： DHA和EPA對(duì)人體有重要的生理功能。它能調(diào)節(jié)人體的脂質(zhì)代謝，治療和預(yù)防心腦血管疾病，促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā)育。實(shí)驗(yàn)部分采用氣相色譜法針對(duì)不同甲酯化條件下對(duì)牛乳中DHA和EPA進(jìn)行測(cè)定研究，對(duì)甲酯化反應(yīng)的時(shí)間、溫度、KOH-甲醇溶液加入量和濃度設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，研究不同條件對(duì)牛乳中DHA和EPA測(cè)定的影響，最終確定甲酯化最佳條件，影響其甲酯化的因素依次為加入量>濃度>時(shí)間>溫度。

關(guān)鍵詞：DHA;甲酯化;氣相色譜

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 儀器與試劑

電子分析天平（AL204，梅特勒）;氣相色譜儀（GC-450，德國(guó)布魯克）渦旋混合儀（IKA）旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（IKA）恒溫水浴鍋（上海一恒）

氨水（AR，天津福晨）;無(wú)水乙醇（AR，天津福晨）;乙醚氫氧化鉀-甲醇（AR，天津福晨）;正己烷（HPLC，天津福晨）;石油醚（AR，天津福晨）;無(wú)水硫酸鈉（AR，天津福晨）;EPA脂肪酸甲酯（上海安譜）;DHA脂肪酸甲酯（上海安譜）

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1色譜條件

a） 毛細(xì)管柱：SP-2560或具有同等性能的柱子;b） 進(jìn)樣口溫度，250℃;c） 分流比：20：1;進(jìn)樣量：1μl;d） 檢測(cè)器溫度：300℃;

d） 程序升溫：初始溫度為80℃;14℃/min升至175℃保持5min。然后以4℃/min升至210℃保持2min;再以2℃/min升至230℃;

1.2.2方法原理

利用氨—乙醇溶液破壞乳的膠體性狀及脂肪球膜，使非脂成分溶解于氨—乙醇溶液中，再用乙醚—石油醚提取出脂肪。脂肪在室溫下在正己烷中與甲醇-氫氧化鉀反應(yīng)快速酯化后進(jìn)行氣相色譜柱分析，氫火焰離子化檢測(cè)器檢測(cè)，以外標(biāo)法定量。

1.2.3待測(cè)樣品溶液的制備

準(zhǔn)確稱(chēng)量10g于平底燒瓶，加2ml氨水輕搖，于65℃水浴回餾15分鐘后，用10ml乙醇沖洗回餾管，冷卻至室溫。將樣品加入250ml分液漏斗中。用25ml乙醚沖洗燒瓶后加入分液漏斗中，再用50ml石油醚分兩次洗滌燒瓶后合并洗液，充分振搖。靜置分層后，分離出水相再用5ml無(wú)水乙醇、15ml乙醚 、15ml石油醚重復(fù)提取。合并有機(jī)相后，用純水洗滌有機(jī)相至中性，將有機(jī)相過(guò)無(wú)水硫酸鈉，除去少量的殘留水。在氮?dú)獗Ｗo(hù)下將樣品濃縮近干。用正己烷沖洗濃縮瓶，定容至10ml，準(zhǔn)確量取2ml提取液，加0.5ml無(wú)水甲醇—?dú)溲趸洺浞终駬u，靜置酯化10分鐘后，取上清液，過(guò)濾，進(jìn)樣。

2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1甲酯化最佳條件的確定

2.1.1 氫氧化鉀‐甲醇溶液濃度的確定

選擇濃度為1mol/L、2mol/L、3mol/L、4mol/L、5mol/L、6mol/L、7mol/L幾個(gè)濃度點(diǎn)經(jīng)過(guò)水解、提取、濃縮、甲酯化、定容，取2ml提取液，分別加0.5ml上述濃度氫氧化鉀‐甲醇溶液，甲酯化10min后取上清液，過(guò)濾，經(jīng)氣相檢測(cè)DHA、EPA含量當(dāng)氫氧化鉀-甲醇濃度到達(dá)4mol/L時(shí)，含量基本上趨于穩(wěn)定，因此選擇氫氧化鉀-甲醇濃度為4mol/L。

2.1.2 氫氧化鉀‐甲醇溶液加入量的確定

樣品經(jīng)處理后，分別加入4mol/L氫氧化鉀‐甲醇溶液0.1ml、0.3ml、0.5ml、0.7ml、0.9ml經(jīng)振揺靜置10min后取上清液，過(guò)濾，經(jīng)氣相檢測(cè)DH、EPA含量前階段隨DHA、EPA隨著氫氧化鉀-甲醇溶液加入量的增加而增加，當(dāng)達(dá)到0.5ml時(shí)達(dá)到最大值，表明甲酯化進(jìn)行完全，因此選用加入量為0.5ml。

2.1.3 甲酯化反應(yīng)時(shí)間的確定

反應(yīng)時(shí)間的長(zhǎng)短直接決定甲酯化是否完全進(jìn)行。經(jīng)處理后的試樣加入0.5ml的4mol/L氫氧化鉀‐甲醇溶液振揺后分別靜置6min、8min、10min、12min、14min后取上清液，過(guò)濾，經(jīng)氣相檢測(cè)DHA、EPA可以看出實(shí)驗(yàn)靜置時(shí)間對(duì)反應(yīng)的影響較小，在反應(yīng)進(jìn)行10min已經(jīng)基本上趨于穩(wěn)定，因此選用反應(yīng)時(shí)間為10min，當(dāng)然在實(shí)際操作中可以適當(dāng)延長(zhǎng)一下。

2.1.4 甲酯化反應(yīng)溫度的確定

經(jīng)處理后的試樣分別加入0.5ml的4mol/L氫氧化鉀‐甲醇溶液振揺后分別在10℃、15℃、20℃、25℃、30℃靜置10min后取上清液，過(guò)濾，經(jīng)氣相檢測(cè)DHA、EPA含量不難看出在一般的室溫條件下都不會(huì)對(duì)結(jié)果造成太大的影響，滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)室的分析要求。

2.2 正交試驗(yàn)的結(jié)果與分析

設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)L9（34），研究脂肪被提取后與氫氧化鉀-甲醇溶液發(fā)生甲酯化反應(yīng)，考察氫氧化鉀-甲醇濃度、加入量、反應(yīng)時(shí)間、溫度、對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，因看出四個(gè)因素對(duì)甲酯化的影響都不太顯著。因素水平中最佳工藝條件為：氫氧化鉀-甲醇濃度為4mol/L或5mol/L，加入量為0.5ml或0.6ml，溫度20℃或25℃，時(shí)間為10min或12min，從試劑節(jié)約、快速分析及柱子的使用壽命等角度考慮選前者為最佳組合。

2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與結(jié)論

2.3.1實(shí)驗(yàn)結(jié)果

采用本檢測(cè)方法，在原料中添加三個(gè)濃度水平（加標(biāo)水平為0.2μg/mL、0.4μg/mL、4.0μg/mL）的兩種混合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（DHA;EPA）進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，結(jié)果樣品的加標(biāo)回收率在83.0-115.6%的范圍內(nèi)，在75%-125%回收率范圍內(nèi)，可以對(duì)樣品進(jìn)行定性定量處理。

2.3.2實(shí)驗(yàn)結(jié)論

（1）室溫對(duì)甲酯化的影響不大，對(duì)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果幾乎沒(méi)有影響，化驗(yàn)室的溫度完全滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)的需要，氫氧化鉀-甲醇的濃度、加入量及靜置時(shí)間對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果都有不同程度的影響，通過(guò)正交試驗(yàn)對(duì)四個(gè)因素分析影響的主次順序?yàn)椋杭尤肓?濃度>時(shí)間>溫度。

（2）通過(guò)對(duì)甲酯化條件單因素變量分析最終確定最佳反應(yīng)條件為氫氧化鉀-甲醇濃度為4mol/L，加入量為0.5ml，反應(yīng)時(shí)間為10min，溫度為20℃。

（3）通過(guò)加標(biāo)驗(yàn)證，回收率比較高同時(shí)也說(shuō)明此方法可行，滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)室日常分析要求。

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