HPD-600大孔吸附樹脂分離茶多酚的研究

王 平， 陳成飛， 戴春偉， 蘇為科

（浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，浙江杭州 310014）

茶多酚（Tea－polyphenols）是茶葉中一類重要的化學(xué)成分，含量一般為18% ～36%［1］。茶多酚主要包括兒茶素（黃烷酮類）、黃酮、黃酮醇類、花青素類、花白素、酚酸及縮酚酸類。其中兒茶素是茶多酚的主要成分，包括表兒茶素（EC）、表兒茶素沒食子酸酯（ECG）、表沒食子兒茶素（EGC）、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）等［1］。茶多酚是一種天然的抗氧化劑，具有很強(qiáng)的消除有害自由基、抗衰老、抗輻射、抗過敏、消炎、抑制癌細(xì)胞、抗菌、殺菌和對艾滋病毒的抑制作用［2］，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于食品、糧油、藥品、精細(xì)化工等各個領(lǐng)域［3～5］。

茶葉中提取茶多酚主要有三種方法［6－10］:溶劑萃取法，離子沉淀法，樹脂吸附法。近年來，具有高度選擇性的吸附樹脂被廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物的提取和純化中，具有提純效率高等優(yōu)點(diǎn)。李冬梅等［11］研究發(fā)現(xiàn)HPD－600大孔吸附樹脂對淫羊藿總黃酮表現(xiàn)出較好的吸附和解吸附性能，而且得到純度高的總黃酮。本實(shí)驗(yàn)選用HPD－600大孔吸附樹脂從茶湯中分離純化茶多酚。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器 主要試劑與原料:乙醇（工業(yè)級，杭州方亭試劑廠）;HPD－600大孔吸附樹脂（河北滄州寶恩化工有限公司）;低質(zhì)粗茶葉（產(chǎn)地為福建大田）;732PC型紫外分光光度計(jì)（上海普光儀器公司）。

1.2 樹脂的預(yù)處理［12］將HPD－600大孔吸附樹脂裝入柱子內(nèi)，先用2%NaOH浸泡2 h后洗脫，流速為2 mL/min，共洗脫2BV，用純水洗至pH中性，再用4BV乙醇洗脫，再用純水洗至無乙醇味，備用。

1.3 茶葉浸提液的制備 稱取100 g茶葉，置于1 000 mL燒瓶中，加入800 mL的水，在80℃水浴中不斷攪拌，浸提3 h后過濾。濾渣再用500 mL的水浸提1 h后過濾。然后濾渣再用500 mL水浸提30 min后濾過。合并3次濾過所得濾液。將濾液濃縮至原體積的1/3，加入3倍量乙醇，出現(xiàn)大量絮狀沉淀，靜置8 h，濾過，得澄清液。澄清液濃縮至一定體積，得到濃縮液。

1.4 靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn) 稱取一定量樹脂，加入一定體積的濃縮液，隔10 min取1 mL上清液進(jìn)行檢測。測定茶多酚的吸附率。

1.5 動態(tài)吸附實(shí)驗(yàn) 采用內(nèi)徑為11 mm的25 mL酸式滴定管作為吸附柱，樹脂層高度8 cm，將濃縮液以3 mL/min的平均流速流過吸附柱。吸附后，先用適量的水洗柱，再用一定濃度的乙醇溶液以1.5 mL/min的平均流速洗脫，并用分光光度法測定流出液中的茶多酚濃度。

1.6 分析測定方法

1.6.1 國標(biāo)法［13］準(zhǔn)確稱取樣品0.1 g樣品（精確至0.000 1 g），置100 mL量瓶中，用蒸餾水溶解，稀釋至刻度，搖勻。準(zhǔn)確吸取試液1 mL，置于25 mL量瓶中，加蒸餾水4 mL和酒石酸亞鐵溶液5 mL，充分混勻，再用pH7.5的磷酸緩沖液定容，以試劑空白液作參比，用10 mL比色杯于540 nm測定吸光度（A）。

A:吸光度;

M:樣品重量（G）;

m:樣品干物率（%）;L1:樣品的總量（mL）;

L2:測定時的用液量（mL）;

1.6.2 高效液相法［14］采用HPLC法定量分析茶多酚和咖啡堿，其檢測條件為，反相色譜柱:ZORBA×SB－Aq（3.0×150 mm），流動相:乙腈－水（體積比為8∶92，用磷酸調(diào)pH值為2.55），檢測波長:280 nm，流速:1 mL/min。分別配制不同濃度的茶多酚和咖啡堿的標(biāo)準(zhǔn)溶液，作HPLC分析測定，得到茶多酚和咖啡堿溶液濃度與相應(yīng)HPLC峰面積的線性關(guān)系式如下:

式中C為濃度（mg/mL），A為HPLC峰的積分峰面積。

2 結(jié)果與討論

2.1 HPD－600大孔吸附樹脂對茶多酚的吸附性能

2.1.1 靜態(tài)吸附方法，用該樹脂對不同比重的濃縮液中茶多酚進(jìn)行靜態(tài)吸附，以國標(biāo)法分析測定茶多酚。

2.1.1.1 靜態(tài)吸附量的考察 配置比重為1.1 g/mL的濃縮液，分別按照濃縮液體積與樹脂質(zhì)量比為4∶1，4∶2，4∶4，4 ∶8，4∶16進(jìn)行考察。結(jié)果見圖1。

圖1 濃縮液體積與樹脂質(zhì)量比

由圖1可知，4∶2（樹脂量:上樣體積）比例的吸附率仍超過95%，說明此時的吸附效果較好;4∶2為較佳上樣比例。

2.1.1.2 茶湯上樣液比重的考察 在6 mL比重為1.1 g/mL的濃縮液中分別加入0，0.67，1.5，2.5 mL的濃縮液使其比重分別為 1.1，1.09，1.08，1.07 g/mL 及比重為 1.12 g/mL和1.15 g/mL的濃縮液，然后吸取適量的試液于2 g樹脂內(nèi)，進(jìn)行靜態(tài)吸附試驗(yàn)，靜置一夜。結(jié)果見圖2。

圖2 上樣液比重對吸附的影響

由圖2可知，比重為1.12 g/mL、1.15 g/mL與1.1 g/mL的茶多酚含量差不多，而且比重高于1.1 g/mL的濃縮液有一定黏度，影響上樣效果。綜上兩點(diǎn)，吸附比重為1.1 g/mL較好。

2.1.1.3 吸附時間的考察 稱取20 g樹脂，加入20 mL比重為1.1 g/mL的濃縮液，隔10 min取上清液檢測。結(jié)果見圖3（由于吸光度值偏大，換算成茶多酚含量值太大，直接用吸光度值表示）。

圖3 吸附時間的影響

由圖3可知:30 min后吸附基本上無變化，認(rèn)為樹脂已經(jīng)吸附飽和。所以，建議吸附時間為30 min。

2.1.2 動態(tài)吸附量的考察 將比重為1.1 g/mL的濃縮液上柱（裝樹脂20 g），做泄漏曲線，共收集6管，共60 mL。用分光光度計(jì)測定。結(jié)果見圖4（由吸光度值偏大，換算成茶多酚含量值太大，直接用吸光值表示）。

圖4 動態(tài)吸附量的考查

由圖4顯示可知:收集量達(dá)到10 mL的時已有泄漏，綜合考慮靜態(tài)吸附試驗(yàn)結(jié)果，確定上樣體積比樹脂質(zhì)量為4∶2（即2∶1）。

2.2 不同乙醇濃度洗脫對茶多酚含量的影響 考察用一定濃度的乙醇洗脫及其對洗脫能力的影響，由實(shí)驗(yàn)可知，洗脫率隨著乙醇濃度的提高而增大，但是當(dāng)乙醇濃度達(dá)到80%后，洗脫率增加緩慢，且高濃度乙醇洗脫會有更多的雜質(zhì)出現(xiàn)。張效林等［14］研究也發(fā)現(xiàn)用一定酸性的10%乙醇溶液對咖啡堿有較好的選擇洗脫能力，故在洗脫之前用一定酸性的10%乙醇溶液進(jìn)行處理。而且我們也證實(shí)在洗脫茶多酚之前用一定酸性的10%乙醇溶液進(jìn)行處理，可以得到咖啡堿含量小于7%的茶多酚產(chǎn)品。

2.3 按較佳條件處理所得最終產(chǎn)品的HPLC檢測結(jié)果 圖5為茶多酚產(chǎn)品HPLC分析測定結(jié)果，表明通過HPD－600大孔吸附樹脂吸附解吸后，可以有效去除部分咖啡堿，組分EGCG含量為40%，咖啡堿殘余量為7%。

圖5 最終茶多酚產(chǎn)品的HPLC色譜

3 結(jié)論

3.1 本工藝上柱前用一定濃度的乙醇，先除去茶湯濃縮液中的雜質(zhì)和茶多糖，增加了樹脂的使用壽命，降低生產(chǎn)成本。

3.2 HPD－600大孔吸附樹脂易吸附茶多酚，而且茶多酚容易被解吸。用80%乙醇洗脫，得到的茶多酚純度達(dá)95%，其中EGCG含量大于40%，而且咖啡堿殘余量小于7%。

3.3 本工藝避免使用氯仿等溶劑，基本無污染。而且咖啡堿與茶多酚的分離分步進(jìn)行，有利于咖啡堿的回收利用。

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