豬圓環病毒2型與豬細小病毒混合感染對仔豬致病性的研究

劉國陽,唐 波,常 晨,華 濤,侯繼波,張道華*

(1.江蘇省農業科學院 動物免疫工程研究所,江蘇 南京 210014;2.江蘇省農業科學院 國家獸用生物制品工程技術研究中心,江蘇 南京 210014;3.江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協同創新中心,江蘇 揚州 225009)

仔豬斷奶后多系統衰竭綜合征(Postweaning multisystemic wasting syndrome, PMWS),是主要由豬圓環病毒(Porcine circovirus, PCV)引起的一類傳染病。其中PCV可以分為PCV1型、PCV2型以及PCV3型,而PCV1型不致病,PCV2型具有致病性,PCV3型的致病性尚未有定論[1-3]。目前,PCV2型被認為是引起PMWS的主要病原。PMWS以仔豬進行性消瘦、淋巴結腫大、肝炎、腎炎、間質性肺炎等癥狀為臨床特征,組織病理學表現為淋巴結肉芽腫性炎癥、巨噬細胞增生、部分臟器淋巴細胞浸潤等[4]。該病最早于1991年加拿大首次發現報道[5-7]；之后Allen等[8-9]通過實驗驗證PCV2與PMWS發病有相關性。國內最早報道PMWS的是郎洪武等[10]，他們通過對臨床材料進行血清學檢測,證明該病在我國是存在的。

一直以來,PMWS是困擾世界上許多養殖業發達國家的重要豬傳染病之一,每年造成了巨大的經濟損失。研究發現,雖然PCV2是引起PMWS發病的主要病原,但單獨感染時并不能導致嚴重的后果。國內外許多學者均已在PMWS臨床診斷中發現,PPV與PCV2存在混合感染[11]。本研究對健康的斷奶仔豬人工感染PPV和PCV2兩種病毒,對仔豬感染后的臨床癥狀和組織病理學變化進行了觀察,對其血清學指標進行了檢測,并對實驗室分離獲得的1株PPV和PCV2對仔豬的致病性進行了評估，以期為PPV和PCV2協同致病模型及二聯疫苗的研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

PCV2 NJ株和PPV NJ株均由國家獸用生物制品工程技術研究中心分離鑒定、保存；PCV2的滴度利用PK-15a細胞增殖可達106.5TCID50/mL；PPV NJ株的滴度利用ST細胞增殖可達107.0TCID50/mL。ST細胞和PK-15a細胞由國家獸用生物制品工程技術研究中心馴化、保存。DNA提取試劑盒購自TaKaRa公司;PCV2 ELISA抗體檢測試劑盒購自武漢科前生物技術有限公司。

篩選PRV、PCV2、PRRSV、PPV抗體陰性,PPV、PCV2抗原陰性的45日齡仔豬,共計20頭,購自江蘇某農戶。所有動物實驗均在江蘇省農業科學院國家獸用生物制品工程技術研究中心實驗動物房進行。

1.2 試驗設計

篩選20頭仔豬,隨機分為4組,分別為空白對照組5頭、PPV單獨感染組5頭、PCV2單獨感染組5頭、PPV和PCV2混合感染組5頭。4組實驗動物全部封閉隔離飼養。在45日齡時,通過滴鼻和肌肉注射方式感染,其中PPV單獨感染組分別以滴鼻和肌肉注射方式各接種1.5 mL PPV NJ株；PCV2單獨感染組分別以滴鼻和肌肉注射方式各接種1.5 mL PCV2 NJ株；PPV和PCV2混合感染組分別以滴鼻和肌肉注射方式各接種1.5 mL PPV NJ株(共計3 mL)和1.5 mL PCV2 NJ株(共計3 mL)；空白對照組分別以滴鼻和肌肉注射方式各接種1.5 mL DMEM培養液。接種劑量PPV NJ株為3×106.0TCID50/頭,PCV2 NJ株為3×105.0TCID50/頭。

在攻毒前稱量每頭豬的體重,在攻毒后觀察記錄臨床癥狀和直腸溫度,并于攻毒后3、5、7、10、14、21、28 d采集血清，備用。在攻毒后28 d剖殺,稱量體重,觀察肺臟、脾臟、肝臟和淋巴結病變。

1.3 試驗仔豬的組織病理學檢查

剖殺仔豬后,采集不同器官(心、肝、脾、肺、腎、扁桃體和淋巴結),取組織病變位置用10%福爾馬林固定；在24 h后取出固定的組織,用梯度乙醇脫水,用二甲苯透明,隨后進行透蠟、包埋、切片、蘇木素-伊紅染色,最后在普通光學顯微鏡下觀察組織形態學變化。

1.4 試驗仔豬病毒血癥的檢測

參照PPV和PCV2分離株的基因序列設計引物(表1),根據DNA提取試劑盒說明書的操作步驟提取PPV和PCV2病毒DNA,采用熒光定量PCR (qPCR)法檢測被攻毒仔豬的病毒血癥。反應程序為:50 ℃ 2 min;95 ℃ 10 min,95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min,40個循環。同時設ddH2O為陰性對照,獲得循環閥值(Ct值),根據標準曲線方程計算血清樣品中PCV2和PPV的核酸拷貝數[12],判斷被攻毒仔豬是否存在病毒血癥。

表1 用于PCR擴增的引物序列

1.5 PCV2 ELISA抗體和PPV HI抗體效價的檢測

采用PCV2 ELISA抗體檢測試劑盒檢測血清IgG抗體,根據試劑盒說明書判定各組PCV2 ELSIA抗體之間的相互關系。PPV HI抗體檢測:參照《中國獸藥典》2015版中的血清HI抗體檢測方法,以能夠抑制50%豚鼠紅細胞凝集的血清最高稀釋倍數以2為底的對數為血清PPV HI抗體效價[13]。

1.6 數據統計分析

應用GraphPad PRISM軟件對試驗數據進行統計分析,P<0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 試驗仔豬的體溫變化

在攻毒后,每日10：00定時測量試驗仔豬的直腸溫度,結果顯示：PPV單獨感染組和空白組體溫無顯著差異；在攻毒后11、12 d，PCV2單獨感染組的仔豬體溫較PPV單獨感染組和空白組有明顯升高,而PPV和PCV2混合感染組的仔豬體溫升高早于PCV2單獨感染組,且持續時間更長(圖1)。上述結果表明,PPV和PCV2混合感染能夠引起仔豬更嚴重的體溫反應。

圖1 試驗豬肛腸溫度的變化

2.2 試驗仔豬平均日增重的變化

在攻毒前和攻毒后剖殺時，分別稱量試驗豬的體重,計算每組試驗豬的日平均增重情況。結果顯示：PPV和PCV2混合感染組豬的平均日增重極顯著低于PPV單獨感染組和空白組(P<0.01),顯著低于PCV2單獨感染組(P<0.05);PCV2單獨感染組豬的平均日增重顯著低于PPV單獨感染組與空白組;PPV單獨感染組與空白組豬的平均日增重無顯著性差異(圖2)。表明,PPV和PCV2混合感染仔豬后能夠導致仔豬生長緩慢,平均日增重下降。

圖柱中標不同大寫字母表示在不同試驗組間差異極顯著(P<0.01)；不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.3 試驗仔豬臨床癥狀及剖檢變化觀察

攻毒后每日觀察試驗豬的精神、采食及臨床變化。結果顯示：PPV和PCV2混合感染組和PCV2單獨感染組豬在攻毒后先后出現食欲減退、精神萎靡、遲鈍、不愿移動等臨床表現,以混合感染組的臨床表現更加嚴重,持續時間更長；在攻毒后10 d混合感染組4/5的試驗豬在四肢和腹部出現泛紅的斑點(圖3A、圖3D)；PPV單獨感染組和空白組無明顯臨床變化。

在攻毒后28 d剖殺試驗仔豬,觀察統計各臟器的病理變化。結果顯示：PPV和PCV2混合感染組豬的肺臟水腫、顏色變淺，部分區域出現肉變且按壓無彈性(圖3B、圖3C)，脾臟有少量出血點,邊緣有明顯的鋸齒狀梗死灶(圖3E)，且淋巴結輕微腫大(圖3F)；PCV2單獨感染組、PPV單獨感染組和空白組豬的各臟器無明顯眼觀變化。表明,PPV和PCV2混合感染仔豬引起的臨床癥狀更加明顯,仔豬的發病程度更加嚴重,證明PPV和PCV2混合感染仔豬能夠增強PCV2引起的臨床癥狀,加重PMWS的發病程度。

2.4 試驗仔豬組織病理學變化

在攻毒后28 d,剖殺試驗仔豬,采集相關臟器固定，制備組織病理學切片,經HE染色后觀察變化。結果發現：PPV單獨感染組和空白組試驗豬無明顯組織病理變化。PCV2單獨感染組部分試驗豬的肺臟和淋巴結出現與PPV和PCV2混合感染組豬相似的病理變化,但混合感染組的試驗豬各臟器均有更加嚴重的組織病變,其中：肺臟肺泡壁增厚,肺泡上皮細胞增生,伴有少量中性粒細胞和淋巴細胞浸潤,支氣管上皮細胞有壞死和脫落(圖4A)；脾臟細胞界限不清,紅髓區增生伴有大量壞死細胞和中性粒細胞(圖4B)；肝臟肝細胞重度水樣變性,胞質疏松呈空泡化(圖4C)；淋巴結淋巴細胞減少,細胞核深染(圖4D)；扁桃體局部區域出現細胞核深染和淋巴細胞浸潤(圖4E)；心臟心肌細胞水樣變性,胞質腫脹、疏松、淡染(圖4F)。表明,PPV和PCV2混合感染仔豬的組織病理變化較單獨感染組和對照組更加嚴重,進一步證明兩種病毒具有相互促進感染的作用,能夠引起更加嚴重的臨床癥狀。

2.5 試驗仔豬血清病毒含量的檢測

分別于攻毒后3、5、7、10、14、21、28 d，采集試驗豬的血樣并分離,提取血清DNA,采用qPCR法檢測各時間點的PPV和PCV2病毒含量。PCV2病毒含量的檢測結果如圖5A所示：PPV和PCV2混合感染5 d后即可檢測到PCV2陽性；PCV2單獨感染組在攻毒后10 d可以檢測到PCV2陽性,但其含量顯著低于混合感染組(P<0.05),直至實驗結束；PPV單獨感染組和空白組未檢測到PCV2陽性。

圖3 各組試驗豬大體眼觀變化

圖4 試驗豬部分臟器組織病理學變化(HE染色,400×)

PPV病毒含量的檢測結果如圖5B所示：在攻毒后5 d,PPV單獨感染組和PPV+PCV2混合感染組均可檢測到PPV陽性,但混合感染組的PPV病毒含量顯著高于PPV單獨感染組(P<0.05)；PCV2單獨感染組和空白組未檢測到PPV陽性。上述結果表明,PPV和PCV2混合感染后,PPV能夠促進PCV2在豬機體內增殖,提高PCV2病毒的含量。

2.6 試驗仔豬抗體檢測結果

采集攻毒后不同時間點的仔豬血清,利用PCV2 ELISA抗體檢測試劑盒檢測血清抗體,結果顯示:PPV單獨感染組和空白組在試驗持續期內,PCV2 ELISA抗體均為陰性;PPV和PCV2混合感染組在攻毒后10 d抗體檢測全部呈陽性；PCV2單獨感染組攻毒后14 d抗體檢測呈陽性；攻毒后14、21、28 d,混合感染組的抗體水平顯著高于PCV2單獨感染組(P<0.05)(圖6A)。

*表示與PCV2單獨感染組相比差異顯著(P<0.05);**表示與PCV2單獨感染組相比差異極顯著(P<0.01);#表示與PPV單獨感染組相比差異顯著(P<0.05)。下圖同。

根據《中國獸藥典》中血清HI抗體檢測方法,檢測不同時間點采集的仔豬血清HI抗體,結果顯示：PCV2單獨感染組和空白組的PPV HI抗體始終保持陰性；PPV和PCV2混合感染組以及PPV單獨感染組在攻毒后7 d全部轉陽,并且在攻毒后14、21、28 d,混合感染組PPV HI抗體水平顯著高于PPV單獨感染組(P<0.05)(圖6B)。表明,PPV和PCV2混合感染仔豬后血清抗體水平較單獨感染組明顯升高, PPV和PCV2能夠相互促進,增強機體的抗體反應。

圖6 試驗豬血清的特異性抗體水平

3 討論

目前普遍認為PCV2是引起PMWS的主要病原,但單獨采用PCV2人工感染斷奶潔凈仔豬很難復制出PMWS的典型癥狀。Ober等[14]研究證實,PCV2與PPV、豬偽狂犬病毒、豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒、豬肺炎支原體等病毒混合感染時,PMWS發病癥狀明顯,甚至能夠導致較高的死亡率,但國內關于兩種病毒混合感染致病性差異的報道較少。

本研究通過控制試驗過程,使得各組動物的感染試驗在相同的環境下進行,避免復雜的外界環境干擾,保證了結果的準確科學性。研究表明,PPV和PCV2混合感染豬表現出的臨床癥狀和組織病理學變化較單獨感染組更為嚴重,血清中病毒含量更高,發病程度更重,表明PPV和PCV2共同感染后強化了PCV2的致病性,這與國外的相關報道[15-18]一致。在共感染組中,所有試驗豬在試驗周期內均出現了厭食、精神萎靡、消瘦等癥狀；在試驗28 d結束時,甚至有1頭共感染仔豬體重呈負增長,生長指標受到嚴重影響。組織病理學切片結果同樣顯示,共感染組較單獨感染組出現更加明顯的組織病理學損傷,脾臟、肝臟、肺臟等組織器官中均有不同程度的病理變化；此外,淋巴組織切片結果發現機體淋巴結出現嚴重的淋巴細胞損失。這些說明PPV和PCV2共感染嚴重破壞了仔豬機體內的免疫系統。

本試驗通過對各組感染豬不同時間點的病毒含量進行檢測,發現PPV和PCV2混合感染組病毒血癥出現的時間更早；qPCR結果顯示攻毒后5 d,即可檢測到血清抗原陽性,直至實驗結束時均呈現陽性結果,與單獨感染組結果相比病毒含量更高,持續時間更長。這進一步驗證了前期的報道結果[19]。另外,通過間接ELISA法和血凝抑制試驗法檢測不同時間點的PCV2和PPV抗體水平，發現：在攻毒后7 d，混合感染組可檢測到PPV HI抗體陽性,而PCV2抗體在攻毒后10 d轉陽,且在攻毒后21 d達到峰值,在28 d試驗結束時稍微降低。這也證明了前期國外關于PPV在機體內先于PCV2病毒復制,PPV和PCV2混合感染后PPV能夠促進PCV2增殖的觀點[20-21]。同時,抗體檢測結果也解釋了本研究中仔豬混合感染后PCV2病毒血癥更加嚴重、持續期更長的原因：PCV2抗體出現較晚,機體受到PCV2侵染后未能及時組織有效的病毒清除系統。

本研究闡明了實驗室新分離的兩株PPV和PCV2混合感染協同致病性作用,各項檢測指標均顯示兩種病毒共同感染的致病性遠遠高于單獨感染,引起的臨床癥狀和病理變化更為嚴重,這可為后期更進一步研究PPV和PCV2混合感染的機理和研制兩種病毒混合感染防控的二聯疫苗提供參考。