豬偽狂犬病毒Real-time PCR檢測方法的建立和弱毒疫苗病毒含量的檢測

華 濤,唐 波,黃 江,常 晨,劉國陽,張雪花,侯繼波,張道華*

(1.江蘇省農業科學院 動物免疫工程研究所,江蘇 南京 210014;2.江蘇省農業科學院 國家獸用生物制品工程技術研究中心,江蘇 南京 210014;3.省部共建國家重點實驗室培育基地/江蘇省食品質量安全重點實驗室,江蘇 南京 210014;4.江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協同創新中心,江蘇 揚州 225009)

豬偽狂犬病(Pseudorabies, PR)是由偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus, PRV)引起的一種以豬發熱、呼吸障礙、流產和腦脊髓炎等為癥狀的急性傳染病,嚴重危害我國養豬業[1]。PRV屬皰疹病毒科、-皰疹病毒亞科,基因組為150 kb的雙股DNA病毒[1]。2011年以后偽狂犬病毒變異嚴重,使我國的疫情更加嚴重[2]。PRV疫苗免疫是預防偽狂犬病最有效的方法,目前我國市場上主要使用的疫苗是BarthaK-61gE基因缺失活疫苗,一些研究顯示其對我國流行毒株的保護力較經典強毒疫苗低[2-3];但隨著研究的深入，Bartha K-61活疫苗對流行毒株同樣也有保護效果[4-5]。目前我國生產PRV活疫苗有50多家企業,不同企業生產的疫苗含PRV量不盡相同,為了提高弱毒疫苗的免疫效果,很多企業將弱毒疫苗配苗標準提高到大于5000 TCID50/頭份的國家標準[6-7]。

PRV基因組含有眾多的基因,其中gB基因在野毒和疫苗株中高度保守,其作為PRV的必需基因參與病毒的感染和復制,缺失后病毒喪失感染性,且其也是病毒重要的保護性抗原,參與誘導免疫保護[8]。因此可以用gB基因序列建立檢測疫苗含量的PCR方法,或用表達的蛋白建立免疫抗體的血清學檢測方法。實時熒光定量PCR技術已被廣泛應用于很多病毒的檢測,不僅可以對檢測的序列進行定性分析,而且可以對其進行準確定量,與常規PCR技術相比有更高的敏感性、特異性和更好的重復性,具有快速和污染幾率低等優點[9]。本實驗采用SYBR Green建立了一種PRV實時熒光定量檢測方法,以期為PRV活疫苗含量的定量分析提供一種簡便快速、經濟和靈敏的檢測方法。本文還利用這種方法對不同病毒滴度的病毒液進行檢測,再與CPE法測出的病毒滴度進行比較分析,研究了熒光定量PCR檢測PRV病毒滴度的可能性。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

BHK-21細胞和PRV Bartha-K61病毒由本實驗室保存;小牛血清、DEME細胞培養液購自Gibico; SYBR Premix Ex Taq、rTaq聚合酶、質粒提取試劑盒、蛋白酶K、BamHⅠ和KpnⅠ等購自寶生物; Gel Extraction Kit 200凝膠回收試劑盒購自Omega; 7種PRV活疫苗購自疫苗經銷商或由豬場贈送。

1.2 實驗儀器

Takara PCR儀器、TANON電泳儀、TANON電泳圖像分析系統、Thermo超微量分光光度計NanoDrop 1000、Roche Light Cycler 480熒光定量PCR儀。

1.3 gB基因質粒標準品的制備

根據JS-2012(KP257591.1)gB基因序列,用Primer 5設計上游和下游引物，其中gB up為5′-GCGTCGGGGTCCTCGCTCT-3′，gB down為5′-CACGTGAACGACATGCTGA-3′。PCR反應體系: Bartha-K61的DNA模板5 μL、dNTP 4 μL、MgCl23 μL、rTaq 0.5 μL、buffer 25 μL、上游和下游引物各1 μL,用H2O補足至50 μL。反應程序:94 ℃ 5 min;94 ℃ 1 min,68 ℃ 1 min,72 ℃ 1 min,共35個循環;72 ℃ 10 min。PCR完成后回收gB基因,連入pMD 18T,經酶切和測序正確后命名為pMD-gB。標準品用NanoDrop 1000檢測質粒濃度,計算并稀釋到1×1010拷貝/μL,經10倍稀釋后于-20 ℃保存。

1.4 熒光定量PCR的建立

對Genbank中多株PRVgB基因進行比對分析,采用Primer 5軟件在gB基因保守區設計引物,P-F:5′-GTCACCCGCGTGCTGATCGTCT-3′；P-R:5′-GGCAACCACCGGCGCTACTTT-3′。用pMD-gB質粒做標準品,經10倍梯度稀釋成1×109、1×108、1×107、1×106、1×105拷貝/μL,進行定量PCR；以起始模板數的對數為X軸,以Ct值為Y軸做回歸曲線,建立標準曲線。熒光定量PCR反應體系: SYBR 10 μL、上游和下游引物各0.4 μL、模板2 μL，用H2O補足至20 μL。用Roche LightCycler 480進行反應。程序:95 ℃ 5 min;95 ℃ 5 s,60 ℃ 15 s,共40個循環;40 ℃ 30 s。溶解曲線程序：95 ℃ 5 s,65 ℃ 15 s,97 ℃ 5 s。

1.5 熒光定量PCR的重復性實驗

采用該熒光定量PCR方法,分別選取1×109、1×108、1×107、1×106、1×105拷貝/μL的質粒標準品進行檢測,進行3次批內和批間重復性實驗,來檢驗本方法的重復性。

1.6 特異性

采用該熒光定量PCR方法對PCV2、PPV、JEV、PRRSV、CSFV等常見豬源病毒的DNA或cDNA進行定量PCR擴增,檢測該方法的特異性。

1.7 敏感性

選取1×109～1×102拷貝/μL共8個濃度梯度進行實時熒光定量PCR反應,并按以上濃度梯度進行常規PCR反應,觀察熒光定量PCR反應和常規PCR反應的敏感性差異。

1.8 病毒DNA的提取和檢測

采用配套稀釋液稀釋送檢疫苗,取病毒液450 μL，加入50 μL 10%SDS和3 μL蛋白酶K,在56 ℃下作用30 min。采用酚∶氯仿法提取病毒DNA,加入30 μL H2O溶解。將108TCID50/mL的PRV Bartha-K61病毒連續進行10倍稀釋,取450 μL不同稀釋度的病毒液按以上方法提取DNA。用已優化的熒光定量PCR檢測方法對樣品進行檢測,將樣品的Ct值與標準曲線進行比對,所得結果即為對應病毒液中病毒基因組的拷貝數。

2 結果與分析

2.1 gB基因標準陽性質粒的制備

在PCR反應后進行電泳，發現了1154 bp的gB基因片段(圖1A)。將gB片段連入pMD18-T,用內切酶BamHⅠ和KpnⅠ對重組質粒進行酶切鑒定,結果表明1154 bp為gB片段,2700 bp為pMD 18-T載體,鑒定正確(圖1B)。測序后將該陽性質粒命名為pMD-gB。

圖1 gB基因常規PCR擴增(A)和pMD-gB質粒BamHⅠ和KpnⅠ酶切鑒定結果(B)

2.2 標準曲線的建立

對標準質粒1×109～1×105拷貝/μL濃度按熒光定量PCR反應進行擴增,得到擴增曲線(圖2A)。用Roche Light Cycler 480分析軟件進行數據分析,獲得標準曲線(圖2B),拷貝數的對數值(X軸)與Ct值(Y軸)之間的線性關系為Y=-3.232X+40.56。溶解曲線(圖2C)表明該產物的TM值在87.5 ℃左右。

2.3 重復性實驗

檢測熒光定量PCR方法的重復性,分別選取1×109、1×108、1×107、1×106、1×105拷貝/μL的質粒樣本,進行3次批內和批間重復性實驗。結果如表1和表2所示,變異系數均小于0.5%,表明本方法具有良好的重復性和穩定性。

表1 批內重復性實驗結果

表2 批間重復性實驗結果

2.4 特異性實驗

用熒光定量PCR方法對PCV2、PPV、JEV、CSFV和PRRSV樣品的DNA或cDNA進行特異性分析,選用1×106拷貝/μL的pMD-gB標準質粒作為標準品對照。結果如圖3所示,除了模板質粒有熒光信號外,其他病毒的DNA或cDNA模板均無反應,說明本方法有較強的特異性。

1: 1×106拷貝/μL pMD-gB質粒; 2: PCV2;3: PPV; 4: JEV; 5: CSFV; 6: PRRSV。

2.5 敏感性實驗

選取1×109～1×102拷貝/μL PRV陽性質粒8個濃度梯度進行實時熒光定量PCR反應,該方法的最低檢出濃度為1×103拷貝/μL(圖4)。常規PCR反應的最低檢出濃度為1×105拷貝/μL(圖5)。表明該實時熒光定量PCR的敏感性比常規PCR高100倍。

2.6 病毒滴度與基因拷貝數的關系

用Bartha-K61病毒接種96孔板中的BHK-21細胞,觀察細胞形態變化,用Karber法計算病毒滴度。提取病毒的DNA,用實時定量PCR確定病毒的基因拷貝數。結果顯示：108、107、106、105和104TCID50/mL病毒液的基因拷貝數分別為9.82×1011、1.32×1011、1.24×1010、1.34×109、1.27×108拷貝/mL。將不同病毒滴度的對數和病毒基因拷貝數的對數進行線性回歸分析,結果見圖6。病毒基因拷貝數的對數與病毒滴度TCID50的對數呈線性關系，線性回歸方程為y=0.978x+4.216,其中y=lg(拷貝數/mL),x=lg(TCID50/mL),相關系數R2=0.9993,說明兩者間有較好的相關性。

圖4 實時熒光定量PCR的敏感性實驗結果

2.7 商品PRV活疫苗的檢測

從7種商品PRV弱毒活疫苗中提取病毒DNA,用熒光定量PCR檢測gB基因的含量,計算7種弱毒活疫苗中的gB基因拷貝數，并采用病毒滴度與基因拷貝數回歸方程計算病毒滴度。結果顯示,疫苗A和C的每頭份PRV病毒gB基因拷貝數明顯高于其他5種活疫苗的,說明不同廠家生產的PRV弱毒活疫苗病毒含量存在明顯的差異。

3 討論

豬偽狂犬病是危害中國當前養豬生產的重要疫病之一,PRV的gE基因缺失弱毒疫苗免疫是預防偽狂犬病最有效的方法[1]。2011以來PRV在中國豬場廣泛流行,給養豬業帶來了巨大損失,雖然有些豬場進行了疫苗接種,但由PRV造成的新生仔豬神經癥狀乃至死亡時有發生[2]。疫苗的質量可能是其原因之一,評價疫苗的參數很多,其中弱毒苗含量是非常重要的參數[6-7]。已知PCR技術能直接檢測病毒種類,特別是熒光定量PCR能夠快速定量檢測疫苗劑量。利用熒光定量PCR技術對疫苗劑量進行使用前的檢測,可以明顯加快疫苗質量檢測,比細胞檢測病毒滴度更加快捷方便[10-12]。

表3 PRV弱毒活疫苗的病毒含量檢測結果

M: DL2000 Marker；1～6：pMD-gB質粒的濃度分別為1×109、1×108、1×107、1×106、1×105和1×104拷貝/μL。

圖6 用CPE法檢測出的PRV滴度與用熒光定量PCR法測得的基因組拷貝數之間的線性關系

熒光定量PCR檢測樣品首先要構建重組質粒標準品,最為常見的建立DNA標準品的方法是向質粒載體中克隆一種病毒的基因序列。PRV的gB基因為2.8 kb,比其他基因保守,是PRV野毒株和基因缺失疫苗毒株的組分之一[8]。因此可以選擇gB基因序列建立檢測偽狂犬病基因缺失疫苗劑量的熒光定量PCR方法。針對PRVgB基因保守區構建重組質粒作為標準品,應用SYBR Green Ⅰ建立一種可檢測PRV載量的熒光定量PCR方法。SYBR GreenⅠ實時熒光定量PCR相比于探針法熒光定量PCR具有成本低、應用范圍廣、變異系數低等特點[9]。

本方法采用gB基因標準質粒進行熒光定量PCR,結果顯示倍比稀釋的標準品熒光曲線相同,間距相等。到了低拷貝數間距變小,原始濃度與Ct值有明顯的線性關系；本實驗的擴增效率為2.039,接近于最高擴增效率2。說明本實驗做出的標準曲線是成功的。重復性實驗選取不同濃度的標準樣品做多次重復檢測,結果顯示批內和批間重復性實驗的變異系數均小于1%,可見本方法的重復性和穩定性較好。特異性實驗結果顯示,由本實驗室保存的PCV2、PPV、JEV、CSFV和PRRSV的DNA或cDNA進行實時定量PCR擴增,結果均無特異性反應,說明本實驗對PRV有良好的特異性。

相關研究發現,被測樣品中原始目的基因的含量和PCR擴增產物的量有良好的對應關系,因此能通過對擴增產物的含量分析來反映被測病毒的實際含量[10-12]。在對多種病毒的研究中,熒光定量PCR檢測病毒滴度已經得到應用,如腺病毒[10]、慢病毒[11]、桿狀病毒[12]等。本實驗對用熒光定量PCR法檢測的PRV病毒基因拷貝數和用CPE法檢測的PRV滴度進行了線性回歸分析,相關系數為0.9993,說明兩者間存在良好的相關性。因此,可以通過分析病毒拷貝數來確定病毒的感染滴度。2種方法比較,熒光定量PCR方法在實際應用中,樣品從提取到檢測大約要4 h,而CPE法則需要鋪細胞板、接毒，在3～5 d后觀察，總時間達5～7 d,而且所得結果有一定的主觀性。因此,相對于CPE法，熒光定量PCR節省了大量時間,降低了測定者的主觀性,更適于大型豬場進行疫苗的快速鑒定和篩選。在成本方面,由于分子生物技術的飛速發展,現在的試劑價格有了很大的降低,而人工成本則顯著提高,因此熒光定量PCR的成本比CPE法低。但病毒受凍融、自身半衰期等因素的影響,感染性病毒數難免要低于總病毒顆粒數。因此,綜合考慮,熒光定量PCR法檢測PRV病毒滴度更適用于豬場進行疫苗的快速檢測或新鮮病毒樣品的檢測。

PRVgE基因缺失弱毒疫苗含量是評價疫苗優劣的重要指標,我國的弱毒疫苗配苗標準為大于5×103TCID50/頭份[6]。本實驗選用江蘇、江西和浙江地區廣泛使用的7種PRVgE基因缺失弱毒疫苗,用熒光定量PCR方法對疫苗的病毒基因拷貝數進行檢測。經定量PCR之后,采用建立的拷貝數和病毒滴度相互關系回歸方程計算病毒滴度,結果顯示各廠家的疫苗在配苗時病毒含量均高于國家制定的標準,應為各廠家在配苗時都考慮到了活疫苗的凍干、保存和凍融損失,與說明書標識含量基本相符。但不同廠家疫苗的PRV含量仍存在明顯的差異,最高與最低含量甚至相差50倍以上,其中2種疫苗顯著高于另外5種疫苗,這2種疫苗從病毒含量來看性價比更好,可能臨床效果更好。但真實的臨床免疫效果是否存在不同,需要臨床試驗進一步確認。

本研究建立了熒光定量PCR法來檢測PRV的gB基因含量,結果表明熒光定量PCR測定的病毒拷貝數與CPE法檢測的病毒滴度有較好的線性關系；對市售疫苗的檢測結果說明所建立的熒光定量PCR法可以快速檢測疫苗的病毒含量,具有很好的臨床參考意義。