鳳丹果實的多果性狀及其形成機制研究

史明偉，祝有為，言燕華，韋武青，徐迎春*

(1.南京農業大學 園藝學院，江蘇 南京 210095；2.鎮江市潤州區林業果茶指導站，江蘇 鎮江 212000；3.鎮江市蔬菜研究所，江蘇 鎮江 212021)

油用牡丹是指種子可加工牡丹籽油的一類牡丹品種。其中鳳丹(Paeoniaostii)由于結實率高，種子產量大，生長適應性強，作為主要栽培的油用牡丹品種在全國大面積推廣。鳳丹是由楊山牡丹長期栽培演化形成的觀賞兼藥用的品種群[1]，與觀賞用的牡丹(P.suffruticosa)并列為植物學上的種，為江南牡丹品種群的一個亞群[2-3]。鳳丹屬于異花授粉植物，雖有一定的自交親和性，但自交親和性很差[4]，需要進行異花異株授粉。長期以來一直用種子繁殖苗木，形成了豐富的自然變異類群。

鳳丹的果實為蓇葖果，由多個小果組成，具有多個心皮。一般認為鳳丹具3～8枚小果[5]，多數品種為5枚。但據沈保安等[6]研究，安徽銅陵鳳凰山和安徽南陵丫山產的鳳丹有一個類群的蓇葖果通常6～8枚，將其定名為多果牡丹PaeoniaostiiT.Hong et J.X.Zhang ssp.lishizhenenii(B.A.Shen)。作者在安徽銅陵的鳳丹田里發現了若干具有6～8枚蓇葖果特征的鳳丹單株，與沈保安所述的多果牡丹在形態上相似。關于多果牡丹目前只有植物學外觀形態特征方面的證據[6]，尚缺乏更科學、更精確的證據以證實其多果特性是一種特異的遺傳性狀。鳳丹果實的蓇葖果由離生心皮雌蕊發育而來，心皮數量決定了最終蓇葖果的數量，鳳丹多果性狀的產生可能受與心皮發育相關基因的調控，目前為止尚未發現關于鳳丹果莢果數的研究報道。

為研究該變異的類型和產生的原因，本試驗選取上一年所結果實分別為5果、6果、7果、8果的鳳丹進行人工異花授粉，試圖探究鳳丹的多果性狀是否可以穩定表達；并且從相關研究文獻中找到與心皮發育相關的基因[7-9]，在鳳丹轉錄組中找到同源基因，選取多果鳳丹花芽為材料，檢測鳳丹中與心皮發育相關的基因在不同果數鳳丹花芽中的相對表達量，試圖找出可能與鳳丹多果性狀產生相關的基因。同時，通過觀察多果鳳丹的生物學特性，以找出多果鳳丹與普通鳳丹的異同，從而研究鳳丹果實果數與產量之間的關系，為進一步探究鳳丹多果性狀產生的原因及培育高產的鳳丹新品種奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

于2014年6月，在安徽銅陵鳳凰山鳳丹生產基地6年生鳳丹植株中，選取了40個具有多果性狀的鳳丹單株，分別標記。單株全部果實小果數均為6、7、8個的植株分別標記為6、7、8果鳳丹(圖1)，以5果普通鳳丹作為對照。

圖1 不同果數鳳丹的果實

1.2 多果鳳丹植株的生長特性觀測

2015年2月15日至5月15日，在鳳丹結果期之前，分別觀察記錄不同生長時期5果、6果、7果、8果鳳丹的生物學特征及物候期。觀測內容為：萌芽期的芽數、芽長與芽寬(每株觀測3個芽)，盛花期單株著花數、花直徑、花期。每組觀察10株。

5月至8月，從結果期至果實采收期對鳳丹結果期的生物學特征進行觀察記錄，具體內容為：株高、冠幅、結果枝葉片數、結果母枝長度與粗度(每株觀測3個母枝)。每組觀測10株。

8月初至9月初，采收成熟的蓇葖果，測量蓇葖果的鮮重、小果的長度、厚度及種子的千粒重，統計單果種子數。

1.3 多果鳳丹植株后代性狀分離情況

2016年4月，按果數不同分別編號A(5果鳳丹)、B(6果鳳丹)、C(7果鳳丹)、D(8果鳳丹)，每種果數的鳳丹選取5株進行試驗，每株選擇3朵花作為母本，每個母本所授的花粉采自相同果數的其它鳳丹單株，分別標記授粉。授粉后，觀察并記錄每朵花上的心皮數量；8月初統計每組自交授粉后的果數，計算不同蓇葖果數量的果實占總果實數量的比例。

1.4 心皮發育相關基因在多果鳳丹中相對表達量的測定

在鳳丹轉錄組文庫中篩選了鳳丹中與心皮發育相關的6個基因，分別為AGAMOUS-1(AG-1)、AGAMOUS-2(AG-2)、AGAMOUS-like8-1(AGL8-1)、AGAMOUS-like8-2(AGL8-2)、AGAMOUS-like62(AGL62)、SPATULA(SPT)。并以前人的研究為基礎，選取了看家基因ubiquitin作為內參基因[10]。根據定量PCR引物設計原則，利用Primer Premier 5.0和Beacon designer 7軟件同時設計6個目的基因的引物，并在NCBI Primer-Blast上對引物的特異性進行檢測，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。引物具體序列見表1。

表1 Real-time PCR檢測中所用基因的引物序列

1.5 數據處理與分析

采用Excel 2007和SPSS軟件對實驗數據進行分析。

2 結果與分析

2.1 多果鳳丹的生物學特性

2.1.1 多果鳳丹株高、冠幅、結果枝的特性 從株高和冠幅的測量結果(表2)可以看出多果鳳丹和普通5果鳳丹在株高和冠幅方面沒有顯著區別。觀察結果(表3)顯示多果鳳丹和普通5果鳳丹之間結果枝長度、結果枝粗度、結果枝上的復葉數、結果母枝長度以及母枝粗度均沒有顯著區別，結果枝長度在45～50 cm，粗度在10～13 mm，復葉數在11～12片；結果母枝長度在14～17 cm，粗度在16～17 mm。多果鳳丹果實結果枝的長度、粗度可以反映多果鳳丹所在枝條的營養貯藏狀況，可見不同果數鳳丹枝條貯藏的營養并無顯著區別。

表2 不同果數鳳丹的株高、冠幅

表3 不同果數鳳丹結果枝的生長特性

2.1.2 多果鳳丹芽的特性 觀察多果鳳丹在萌芽期芽的部分特性(表4)，結果顯示不同果數的鳳丹在芽數量和芽長度上無明顯區別，芽數均在17～20個，芽長在4.2～4.6 cm。但多果鳳丹的芽寬均大于5果鳳丹，其中以8果鳳丹的芽寬最大，7果鳳丹次之，6果鳳丹的芽寬稍高于對照，而從芽的長寬比也可以看出這種差別。

表4 不同果數鳳丹芽的特性

2.1.3 多果鳳丹的開花特性 從4月中旬開始，分別觀測多果鳳丹盛花期的著花數、花直徑以及開花持續時間(表5)。結果顯示：不同果數鳳丹之間在著花數和花期方面沒有顯著區別，由于引種時間短，每株鳳丹上的著花數都不多，平均在3個左右，少數出現5～7朵花，花期持續時間均在13～14 d。但從花朵直徑來看，多果鳳丹尤其是7果、8果鳳丹的花朵直徑要大于5果鳳丹和6果鳳丹。

表5 不同果數鳳丹的開花特性

2.1.4 多果鳳丹人工異花授粉后性狀分離情況 通過對結實后果實心皮(表6)的觀察發現，多果鳳丹的果數與前一年相比發生了較大變化。在單株鳳丹上結的果實出現不同果數的現象，原5果鳳丹果實果數變化不大，授粉后15朵花有1朵結出的果實枯萎，沒有結籽，其余14朵仍為5果果實，占5果鳳丹所結果實數量的100%；而原6果鳳丹中出現了47%五果的果實和53% 6果的果實；原7果鳳丹所結果實中五果果實占33%，六果果實占20%，7果果實數量最多，占47%；原8果鳳丹中15朵花也全部結實，5果、6果、7果、8果的果實都有，在所結果實總量的比例分別為27%、20%、27%、26%。

另外，在授粉后，聚合心皮剛剛分離時對心皮數量的觀察發現，有少數授粉后的花心皮數量超過8個，最多的達到10個心皮，但絕大多數花的心皮數仍為5～8個(圖2)。后續觀察發現，多心皮的花多數心皮在發育過程中會逐漸萎蔫、脫落，最終會留下5～8個心皮發育成熟。

A：心皮數為5；B：心皮數為7；C：心皮數為10。

2.1.5 多果鳳丹成熟果實和種子品質的情況 考察多果鳳丹果實和種子的品質特征，可以看出(表7)，不同果數鳳丹新采單個果實的大小(直徑和厚度)基本沒有變化，但果實的鮮重隨著蓇葖果數量的增加而增大。單果結籽數同樣隨著單個果實蓇葖果數量的增加而增多，說明果莢數量的增多會帶來單果結籽量的增大。而從作為種子質量的重要指標之一的千粒重來看，6果、7果鳳丹的種子較5果鳳丹種子更加飽滿，但8果鳳丹雖然單果結籽量最大，但千粒重最小。

2.2 心皮發育相關基因在多果鳳丹中的表達特征

本試驗通過實時熒光定量的方法測定了鳳丹中6個與心皮發育相關的基因分別在5果、6果、7果、8果鳳丹中的相對表達量。從圖3可以看出，各目的基因在不同果數鳳丹中的表達情況也各不相同。AG-1和AG-2在普通5果鳳丹中的相對表達量最高，而它們在6果、7果和8果鳳丹中相對表達量差別不大，卻都明顯低于在普通5果鳳丹中的相對表達量。AGL8-1和AGL62同樣在普通5果鳳丹中表達量最高，而隨著果數增加，這兩個基因的相對表達量呈逐漸減少的趨勢，且在8果鳳丹中的相對表達量都顯著低于5果鳳丹。AGL8-2在不同果數鳳丹中的表達情況相似，沒有明顯差別，但在8果鳳丹中同樣表達略少。SPT則在8果鳳丹中相對表達量最高，而在6果和7果鳳丹中相對表達量又很低，沒有呈現出任何規律。

表6 授粉后成熟蓇葖果數量的變化 %

表7 成熟果實和種子的品質指標

圖3 實時熒光定量PCR分析鳳丹心皮發育相關基因的相對表達量

3 討論

3.1 多果鳳丹的生物學特征

本研究所觀測的多果鳳丹，其萌芽期、開花期及結果期等基本物候期與普通5果鳳丹基本一致，沒有顯著差異，均在2月中下旬開始萌芽，4月初陸續開花，果實成熟時間一般為8月中上旬。除此之外，多果鳳丹的株高、冠幅、萌芽數、著花數、結果枝特性、果實的直徑與厚度都與5果鳳丹相似，但多果鳳丹較5果鳳丹的芽、花直徑更大，芽長寬比更小。沈保安[6]在安徽發現的多果牡丹花的直徑可達到14～20 cm，而本研究觀測的多果鳳丹花的直徑多在9～10 cm，與沈保安發現的多果牡丹有一定的差異，主要原因是本研究觀測的是6年生鳳丹。此外，除了具8個蓇葖果的鳳丹外，其余多果鳳丹的千粒重均顯著大于正常鳳丹果實，這是因為具8個蓇葖果的果實所結種子的數量過多時，種子生長空間受限，營養不足，會使得許多種子干癟，籽粒不夠飽滿，種子體積小，進而導致千粒重顯著下降。

3.2 心皮發育相關基因在不同果數鳳丹中的表達特征

本研究發現，在人工異花授粉后，有些果實開始心皮數較多，隨著果實的成熟，有些果實便會逐漸干癟、脫落，最終得到的蓇葖果數量仍在5～8個，初步推測鳳丹多果性狀可能是由基因控制的可遺傳的性狀。擬南芥心皮發育主要受CRABSCLAW及SPT基因的控制，兩者都屬于MADSbox基因家族成員[11]。趙燕等[11]選取擬南芥和薺菜為材料，將擬南芥CRABSCLAW基因和克隆的薺菜CRABSCLAW同源基因cDNA交互轉化后，兩者的心皮形態和大小都發生了變化，可見心皮發育受基因調控顯著。本試驗結果顯示，AG-1和AG-2在普通5果鳳丹中的相對表達量顯著高于其在其他多果鳳丹中的相對表達量，可以推測這兩個基因的表達有可能會抑制多果的形成。在鳳丹果莢形成過程中，我們觀察到鳳丹授粉后，心皮剛剛分離時，心皮數量可能會多達10個，但最終多出的心皮會在發育過程中萎縮死亡，最終留下5個心皮發育成熟。如果該死亡過程是基因導致的程序性死亡，那么根據多果鳳丹中AG-1和AG-2兩個基因的表達量顯著減少，推測AG-1和AG-2基因有可能參與調控多余心皮的程序性死亡。AGL8-1和AGL62的相對表達量會隨著果數增加呈逐漸減少的趨勢，且在8果鳳丹中的相對表達量都顯著低于5果鳳丹。由此推測，AGL8-1和AGL62基因也可能參與了鳳丹果莢果數最終形成的過程，這兩個基因的表達量可能與最終鳳丹果莢成熟時心皮的數量有關。

綜合上述試驗結果來看，多果鳳丹比普通鳳丹芽直徑、花朵大，千粒重大，其他生物學特性基本一致。鳳丹多果性狀可能是由控制心皮發育的相關基因AG-1、AG-2、AGL8-1和AGL62調控的，后續還需進行嫁接試驗來進一步驗證多果性狀是否為可遺傳的特異性狀；7果鳳丹結籽量大，種子飽滿，果實重量適中，符合高產優質的育種要求，可以作為優良品種進行選育。