異源表達(dá)CmSAMDC基因擬南芥的耐鹽性分析

劉長(zhǎng)命,楊 娜,文 丹,路夢(mèng)夢(mèng),明田田

(商洛學(xué)院,陜西 商洛 726000)

鹽脅迫是植物生長(zhǎng)發(fā)育中最為嚴(yán)重的非生物脅迫因素之一。目前,全球被鹽漬化的陸地面積約占10%,中國(guó)的鹽漬土面積近1億hm2,并且有日趨擴(kuò)大的趨勢(shì)。對(duì)植物耐鹽機(jī)理進(jìn)行深入研究,將有助于培育耐鹽性強(qiáng)的植物品種,并對(duì)生態(tài)環(huán)境改善也具有積極的指導(dǎo)意義[1]。

近年來(lái),多胺代謝途徑已被作為植物潛在抗性的研究目標(biāo),涉及多胺代謝的相關(guān)基因也越來(lái)越被重視。研究發(fā)現(xiàn),在遭受冷害[2]或鹽脅迫[3]時(shí),黃瓜和向日葵的內(nèi)源多胺合成與代謝途徑都發(fā)生了改變,并且抗性品種能合成更多的多胺來(lái)抵御脅迫[4-6]。

19-腺苷甲硫氨酸脫羧酶(SAMDC)是精胺和亞精胺合成過(guò)程中的關(guān)鍵酶,該酶參與了多數(shù)植物的抗性反應(yīng)過(guò)程[7]。作者前期研究[8-11]顯示,轉(zhuǎn)CmSAMDC基因的擬南芥植株對(duì)白粉病的抗性明顯增強(qiáng)。為了進(jìn)一步探明CmSAMDC基因在響應(yīng)非生物脅迫中的作用,本研究以已獲得的轉(zhuǎn)基因擬南芥為材料,對(duì)其耐鹽性進(jìn)行了分析,以期為利用該基因進(jìn)行甜瓜耐鹽性改良提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

轉(zhuǎn)基因擬南芥株系TA1、TB1為前期研究獲得,將野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥T3代種子消毒和清洗干凈，待用。

1.2 方法

1.2.1 目標(biāo)基因的定量和半定量表達(dá)分析 選取6周齡T3代轉(zhuǎn)基因擬南芥植株葉片,利用引物CmSAMDC F:5′-ATCAAAACTTGCGGCACTAC-3′和CmSAMDC R:5′-AGCACCCTCACAATCAACTTAG-3′進(jìn)行定量和半定量分析。實(shí)時(shí)定量程序?yàn)?95 ℃ 30 s;95 ℃ 20 s,60 ℃ 20 s,72 ℃ 20 s,40個(gè)循環(huán)；以擬南芥的Actin2基因作為內(nèi)參。半定量程序?yàn)?94 ℃ 2 min;94 ℃ 20 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,25個(gè)循環(huán);72 ℃ 10 min。

1.2.2 轉(zhuǎn)基因擬南芥發(fā)芽率的測(cè)定 將T3轉(zhuǎn)基因植株和野生型擬南芥的種子用75%酒精和10% NaClO消毒，然后隨機(jī)取100粒,播于含不同濃度(0、100、150、200、300 mmol/L)NaCl的MS培養(yǎng)基上,6 d后統(tǒng)計(jì)發(fā)芽情況。

1.2.3 轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗的根長(zhǎng)及側(cè)根數(shù)測(cè)定 將MS培養(yǎng)基上生長(zhǎng)15 d的T3代轉(zhuǎn)基因幼苗和野生型擬南芥幼苗移至含不同濃度(0、100、150、200、300 mmol/L)NaCl的MS培養(yǎng)基上,繼續(xù)生長(zhǎng)15 d后測(cè)定其根長(zhǎng)和側(cè)根數(shù)。

1.2.4 轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗的耐鹽性鑒定 將MS培養(yǎng)基上生長(zhǎng)15 d的T3代轉(zhuǎn)基因幼苗和野生型擬南芥幼苗移栽入盆(培養(yǎng)基質(zhì)為蛭石∶壤土∶草木灰=1∶1∶1),培養(yǎng)至4周齡時(shí),每穴分別澆灌15 mL 200 mmol/L或400 mmol/L NaCl溶液,每2 d澆灌1次,在處理12 d后測(cè)定脂質(zhì)過(guò)氧化水平(MDA含量)。

1.2.5 轉(zhuǎn)基因擬南芥激素含量的測(cè)定 油菜素內(nèi)酯(Brassinolide, BR)、茉莉酸甲酯(Methyl jasmonate, JA-me)、脫落酸(Abscisic acid, ABA)、赤霉素(Gibberellin, GA)、吲哚丙酸(Indole propionic acid, IPA)、玉米素(Zeatin riboside, ZR)和吲哚乙酸(Indole acetic acid, IAA)的提取參照黃志[12]的方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 目標(biāo)基因的表達(dá)分析

通過(guò)轉(zhuǎn)基因植株篩選,并對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥T3代植株進(jìn)行CmSAMDC基因表達(dá)分析，結(jié)果(圖1)顯示,CmSAMDC基因成功在轉(zhuǎn)基因株系TA1和TB1中表達(dá)。

TA1和TB1代表轉(zhuǎn)基因株系；WT代表野生型擬南芥。下同。

2.2 鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因擬南芥的發(fā)芽率

對(duì)轉(zhuǎn)基因T3代株系TA1、TB1和野生型擬南芥植株(WT)的種子發(fā)芽率進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)：在含100、150、200 mmol/L NaCl條件下,轉(zhuǎn)基因T3代種子的發(fā)芽率分別為86%、70%和45%,而野生型擬南芥種子的發(fā)芽率分別為75%、58%和25%,T3代種子的發(fā)芽率均顯著高于野生型植株的；而在不含鹽溶液(0 mmol/L)的MS培養(yǎng)基上,兩者的種子發(fā)芽率無(wú)顯著性差異(圖2)。

2.3 鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗的根長(zhǎng)及側(cè)根數(shù)

對(duì)根系觀察結(jié)果(圖3)顯示：在不含鹽溶液(0 mmol/L)的MS培養(yǎng)基上,轉(zhuǎn)基因T3代植株的根長(zhǎng)略大于野生型植株,但差異未達(dá)到顯著性水平，側(cè)根數(shù)也無(wú)顯著性差異；在100 mmol/L鹽脅迫條件下,T3代植株的側(cè)根數(shù)明顯多于野生型植株,差異達(dá)到了極顯著水平,而根長(zhǎng)無(wú)顯著差異;在150 mmol/L鹽脅迫條件下,T3代植株的側(cè)根數(shù)和根長(zhǎng)均顯著高于野生型植株;在200 mmol/L鹽脅迫條件下,兩種材料的根系和側(cè)根生長(zhǎng)均受到了明顯抑制。

2.4 鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的生長(zhǎng)情況

將MS培養(yǎng)基上15日齡的幼苗進(jìn)行移栽,緩苗3 d后隔日澆1次不同濃度的NaCl溶液。用200 mmol/L鹽溶液處理8 d后,轉(zhuǎn)基因植株與對(duì)照植株(CK)生長(zhǎng)基本一致,而野生型植株的葉片呈現(xiàn)輕微黃化;在處理16 d后,野生型植株明顯小于轉(zhuǎn)基因植株。用400 mmol/L鹽溶液處理8 d后,轉(zhuǎn)基因植株生長(zhǎng)受阻,但較野生型植株的受阻程度要輕;處理16 d后,野生型植株已經(jīng)死亡,而轉(zhuǎn)基因植株仍能繼續(xù)存活(圖4A)。經(jīng)不同濃度鹽溶液處理后12 d,植株的脂質(zhì)過(guò)氧化程度(MDA含量)存在顯著性差異,即經(jīng)200 mmol/L與400 mmol/L濃度鹽溶液處理12 d后，TA1植株的MDA含量比對(duì)照分別上升了50%和196%, TB1比對(duì)照分別上升了28%和150%,野生型植株比對(duì)照分別上升了92%和376%。總體來(lái)看,轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的耐鹽性明顯強(qiáng)于野生型擬南芥。

圖2 鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因擬南芥的發(fā)芽率

A:轉(zhuǎn)基因T3代和WT幼苗根系的生長(zhǎng)情況; B:轉(zhuǎn)基因T3代和WT幼苗的相對(duì)根長(zhǎng); C:轉(zhuǎn)基因T3代和WT幼苗的側(cè)根數(shù)。

A:鹽脅迫后8 d和16 d的植株表型; B:鹽脅迫后12 d的MDA含量(鮮重)。

2.5 轉(zhuǎn)基因擬南芥植株激素含量的變化

對(duì)轉(zhuǎn)基因株系TA1和TB1的內(nèi)源激素含量測(cè)定的結(jié)果(圖5)表明：GA、ZR、IPA、IAA的含量均表現(xiàn)為T(mén)A1>WT>TB1; BR含量表現(xiàn)為兩個(gè)轉(zhuǎn)基因植株高于WT植株,而JA-me含量卻同時(shí)低于WT; ABA的含量呈現(xiàn)為WT>TB1>TA1。各激素含量在轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株間未表現(xiàn)出規(guī)律性的對(duì)應(yīng)關(guān)系。

圖5 轉(zhuǎn)CmSAMDC基因擬南芥植株激素含量(鮮重)的變化

3 討論

植物在長(zhǎng)期進(jìn)化中,常通過(guò)調(diào)控細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)水平來(lái)調(diào)節(jié)脅迫應(yīng)答保護(hù)機(jī)制。SAMDC是Spd和Spm合成的關(guān)鍵基因,它涉及到眾多植物對(duì)非生物脅迫和生物脅迫的抗性反應(yīng)過(guò)程,在植物生長(zhǎng)發(fā)育、代謝調(diào)控及脅迫響應(yīng)中均具有重要的作用[13-15]。Hazarika研究表明[4],SAMDC基因廣泛涉及冷害、高溫及鹽脅迫等的抗性反應(yīng),且一些轉(zhuǎn)SAMDC基因的植物表現(xiàn)出了對(duì)外界脅迫的廣譜抗性。Roy and Wu[16]利用六倍體小麥的SAMDC基因進(jìn)行水稻轉(zhuǎn)化,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因水稻在鹽脅迫下仍能正常生長(zhǎng)發(fā)育,其內(nèi)源亞精胺和精胺含量增加達(dá)3～4倍。Franceschetti等[17]將擬南芥的SAMDC基因轉(zhuǎn)入煙草,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因煙草表現(xiàn)出了多種脅迫抗性。Waie and Rajam[18]用人的SAMDC基因轉(zhuǎn)化煙草,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)干旱和鹽脅迫表現(xiàn)出更高的抗性。Peremarti等研究還認(rèn)為, spd和spm在抵御干旱脅迫中可能起著清除自由基的作用[19]。本研究也發(fā)現(xiàn),在100或150 mmol/L NaCl脅迫下,轉(zhuǎn)CmSAMDC基因擬南芥植株的根長(zhǎng)和側(cè)根數(shù)均多于野生型植株;在對(duì)4周齡轉(zhuǎn)基因植株幼苗澆灌不同濃度的鹽溶液時(shí),發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株較野生型植株具有更強(qiáng)的耐鹽性。

在植物受到脅迫后,多胺在次生代謝調(diào)控及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著重要的作用[20]。本研究發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)基因擬南芥植株在鹽脅迫下的MDA含量較野生型低,說(shuō)明轉(zhuǎn)CmSAMDC基因擬南芥植株在受到外界脅迫時(shí),為了減少活性氧積累造成的傷害,會(huì)激發(fā)多種信號(hào)物質(zhì),如多胺,協(xié)調(diào)各種活性氧清除系統(tǒng),達(dá)到體內(nèi)活性氧的代謝平衡。但是,CmSAMDC基因和多胺類(lèi)物質(zhì)是如何參與植株的耐鹽性調(diào)控還不得而知。今后有必要對(duì)多胺代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò),以及由其直接或間接調(diào)控的潛在抗性基因或物質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步探討。