不同產地黃芩種子質量差異及等級劃分研究

(陜西師范大學西北瀕危藥材資源開發國家工程實驗室，藥用資源與天然藥物化學教育部重點實驗室，陜西 西安 710119)

優質的種子是實現中藥材規范化生產的基礎和首要條件，也是優質中藥材生產的源頭。但是，目前我國中藥種子缺乏全面系統的質量標準。除了人參、三七、甘草等少數幾種中藥材種子建立了國家標準之外，很多中藥材種子還處于無標準狀態。近年來，隨著中醫藥的不斷發展，關于種子質量差異及等級劃分標準的研究越來越多，如三七[1]、銀柴胡[2]、蒙古黃芪[3]、秦艽[4]、王不留行[5]、續斷[6]等。

中藥黃芩的基源植物為唇形科植物黃芩(Scutellariabaicalensis)，以根入藥，具有清熱燥濕，瀉火解毒，止血，安胎的功效[7]。其發揮藥效作用的化學成分主要是黃酮類成分，具有抗氧化、抗腫瘤、抗菌消炎等藥理作用[8]。黃芩種子質量及其等級標準研究已有相關報道，孫志蓉等[9]通過測定黃芩質量評價指標和田間育苗試驗對黃芩種子質量進行了研究，并按種子大小進行等級劃分；王峰偉等[10]研究不同來源黃芩種子質量差異，并進行了質量評價指標的相關性分析；李云靜等[11-12]以《農作物種子檢驗規程》為參照，建立了黃芩種子的質量檢驗方法，并基于多元統計分析方法，進行了黃芩種子質量分級方法的研究。但是，這些報道都以市場銷售的黃芩種子為研究材料，對于在傳統小農經濟下的農戶自采自種的種子質量研究還未見報道；而且不同的種子質量等級研究對于黃芩種子的質量等級劃分存在不統一、不一致現象，難以對種子的質量進行有效的控制和評價。

本研究首次以農戶家中實地收集到的10份不同產地的自種自采的黃芩種子為材料，通過測定黃芩種子的凈度、含水量、千粒重、發芽率、生活力、發芽勢等指標來評價不同來源黃芩種子的質量差異。并利用SPSS 25.0軟件進行了相關性分析、主成分分析、系統聚類分析、K-均值聚類分析后，通過綜合分析并結合實際生產情況，對所收集黃芩種子進行了質量等級劃分，以期為后續黃芩種子質量評價及質量標準的制訂提供參考。

1 材料與儀器試劑

1.1 供試材料

供試材料為2018年7—10月調研全國主要產區黃芩生產種植情況時收集的10份黃芩種子。經陜西師范大學植物學教研室鑒定為唇形科植物黃芩(Scutellariabaicalensis)的成熟種子。供試材料信息見表1。

表1 供試黃芩種子信息表

1.2 儀 器

人工氣候箱(中儀國科(北京)科技有限公司)，WG-71電熱鼓風干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司)，實驗室PH計PE 20(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)，電子天平(賽多利斯科學儀器(北京)有限公司)。

1.3 試 劑

純凈水(自制)，無水乙醇(天津市天士力化學試劑有限公司)，2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)(北京酷來搏科技有限公司)。

2 實驗方法

2.1 扦 樣

參照《農作物種子檢驗規程扦樣》(GB/T 3543.2)的標準執行[13]。凈度分析試驗樣品不少于2 500粒種子，送檢樣品量應不少于凈度分析10倍量原則，確定凈度分析的最小樣品量不少于5 g。

2.2 凈度分析

參照《農作物種子檢驗規程凈度分析》(GB/T 3543.3)執行[13]。采用四分法分取試驗樣品，將扦樣得到的種子，分別稱取20 g。放置于干凈白板，用鑷子將凈種子中的雜草種子、破碎干癟種子、殘留莖葉碎屑、細小石塊等雜質選出。稱重，重復3次。計算種子凈度：

種子凈度(%)=(凈種子重量/樣品重量)×100%。

2.3 水分測定

依照《農作物種子檢驗規程水分測定》(GB/T 3543.6)執行[13]。試驗采用高溫烘干法，在(135±1)℃高溫條件下烘干4 h測定每批種子的含水量。按下式計算種子含水量:

種子含水量(%)=[(M2-M3)/(M2-M1)]×100%。

M1為樣品盒質量，M2為樣品盒及樣品烘干前質量，M3為樣品盒及樣品烘干后質量。

2.4 重量測定[11]

將凈度分析后的凈種子均勻混合，采用“四分法”取樣。從中隨機抽取試驗所需要的種子數目，分別用百粒法、五百粒法和千粒法3種不同方法測定每份樣品的重量。其中百粒法和五百粒法重復3次，千粒法重復2次。分別計算平均值及變異系數。

2.5 種子生活力測定(TTC法)[14]

稱取2.5 g TTC放入燒杯中，先加少許95%的乙醇溶解后，加蒸餾水后稀釋定容至250 mL，再用1 mol·L-1的NaOH溶液調pH至7.0，配成1%TTC溶液，避光保存。對黃芩種子用水浸種24 h，挑選相對飽滿健全的種子(每處理3次重復，每選取50粒)，除去種皮，將種仁放入裝有1% TTC的染色器皿中，使染色液液面沒過種子表面，在25 ℃條件下染色8 h。倒出TTC溶液，用清水將種子沖洗1～2次，觀察種子染色情況。凡種胚全部或大部分被染成紅色的即為具有生活力的種子，種胚不被染色的為失去生活力的種子。

2.6 發芽率(勢)的測定

挑選飽滿成熟種子放置鋪有2層濾紙的培養皿中，在溫度25 ℃、光照/黑暗12 h/12 h條件下測定發芽率(勢)。每隔12 h記錄發芽數。每次實驗為100粒種子，每個產地重復3次。種子發芽以種子露出胚軸為準。

發芽率(%)=(11 d內種子發芽數/供試種子數)×100%；

發芽勢(%)=(5 d內種子發芽數/供試種子數)×100%。

3 結果與分析

3.1 凈度及含水量檢驗

從表2可以看出，陜西府谷的黃芩種子凈度最高為95.60%，來自山西芮城的黃芩種子凈度最低為69.10%，凈度達到91.00%以上的黃芩種子有7份，占測試樣品的70.00%。不同來源黃芩種子含水量差異明顯，各批次種子含水量在5.63%～10.59%之間，平均含水量為7.90%。其中山西聞喜含水量最高，甘肅隴西含水量最低。說明農戶對自種種子的凈度處理比較隨意，種子凈度普遍偏低，種子干燥程度不一致，影響著后續黃芩種植的播種量以及長期保存。

表2 黃芩種子的凈度及含水量分析(±s，n=3)

注：M1為樣品盒質量，M2為樣品盒及樣品烘干前質量，M3為樣品盒及樣品烘干后質量；同列大寫字母表示p<0.01水平下的差異顯著性，同列小寫字母表示p<0.05水平下的差異顯著性。下同。

表3 黃芩種子千粒重的不同測定方法比較(±s，n=3)

表4 黃芩種子的發芽率、發芽勢及生活力分析

3.2 千粒重檢驗

對不同來源的種子分別采用百粒法、五百粒法、千粒法測定黃芩的千粒重，分析結果見表3。通過方差分析，不同方法間無顯著性差異(p>0.05)，并且變異系數均小于3%，測定值均有效。因此，這3種方法均可用于黃芩種子的重量測定。這與相關文獻報道的五百粒法和千粒法可用于黃芩種子的重量測定，百粒法不適宜千粒重測定的結果不盡相同，有待進一步的研究[11]。不同來源黃芩種子間千粒重差異極顯著(p<0.01)，千粒重最小為1.451 0 g，最大為1.941 8 g。其中，范圍在1.50～1.80 g的種子占樣品總量的60%，說明黃芩種子的千粒質量主要集中在此范圍內。

3.3 發芽率、發芽勢及生活力檢驗

不同來源黃芩種子發芽率、發芽勢都存在極顯著性差異(p<0.01)。由表4可知，山西陽城的發芽率最高，達到78.33%；山東莒縣的發芽率最低，只有41.33%。平均發芽率為63.53%，低于平均發芽率的有5份，占到總數的50%，可見采集到的黃芩種子發芽率普遍偏低。各批次材料發芽勢在39.67%～76.67%之間，不同試驗種子間差異明顯，平均發芽勢為59.53%。筆者在實地取樣過程中發現，不同產地存在黃芩種子播種量差異大、出苗不齊的現象，猜測可能與農戶自收種子的發芽率(勢)存在顯著差異有關。各批次試驗材料生活力在23.33%～94.66%之間，不同試驗種子存在極顯著差異(p<0.01)，其中，山東莒縣的種子生活力最低，為23.33%，甘肅漳縣次之，為54.00%。其余各批樣品生活力均在70%以上，除山東莒縣外，其余各批次平均生活力為79.92%。研究發現，農戶自種自采的黃芩種子發芽率、發芽勢以及生活力都普遍偏低，而且不同產地之間差異極顯著。

表5 黃芩種子各指標測定結果均值(n=3)

3.4 測定指標匯總

黃芩種子測定指標數據平均值匯總，見表5。

4 黃芩種子質量分析與分級

4.1 相關性分析

相關性分析結果見表6，黃芩種子的凈度和水分、千粒重、發芽率發芽勢呈正相關關系，與生活力呈負相關關系，均沒有達到顯著水平；種子含水量與千粒重、發芽率、發芽勢呈負相關關系，與生活力呈正相關關系，未達到顯著水平；黃芩種子的千粒重與發芽率、生活力、發芽勢呈負相關關系，未達到顯著水平；黃芩種子發芽率與生活力呈顯著正相關關系，相關系數達到0.764，與發芽勢達到極顯著正相關關系，相關系數為0.972；生活力與發芽勢呈顯著正相關關系，相關系數為0.652。

表6 黃芩種子質量分級標準指標相關性分析

注：*表示在0.05水平相關性顯著，**表示在0.01水平相關性顯著。

4.2 主成分分析及結果

主成分分析結果見表7，前3個特征值累積貢獻率已達到90.587，說明前3個主成分基本包含了全部的指標信息。取前3個特征值，并計算出相應的特征向量。前3個主成分為：

F1=-0.152X1-0.158X2-0.265X3+0.331X4+0.319X5+0.325X6；

F2=0.498X1-0.548X2+0.522X3+0.348X4-0.325X5+0.376X6；

F3=0.879X1+0.796X2+0.144 5X3+0.991X4+0.431X5+0.621X6。

式中：X1為凈度；X2為水分；X3為千粒重；X4為發芽率；X5為生活力；X6為發芽勢。

綜合來看，在第1主成分表達式中，發芽率X4、生活力X5、發芽勢X6指標的系數較大，由4.1相關性分析得知，發芽率和發芽勢呈極顯著相關，可以將二者合并為一項即發芽率作為種子等級劃分標準，又因第1主成分的方差貢獻率最高，因此，本研究將發芽率和生活力作為黃芩種子分級的主要指標，千粒重和凈度為參考指標。

表7 主成分方差貢獻

4.3 系統聚類分析及結果

聚類分析結果見圖1，10批種子在閾值為5處聚為3類。第一類群包括2(山西芮城)、3(山西夏縣)、4(山西襄汾)、5(山西陽城)、7(陜西府谷)、8(甘肅隴西)6份材料，該類群具有發芽率高、生活力強的顯著優勢；第二類群包括6(山西聞喜)、9(甘肅漳縣)、10(甘肅宕昌)3份材料，為中間類群；第三類群包括1(山東莒縣)1份材料，該類群具有發芽率、生活力都最低。所以可以將黃芩種子分為即優、良和不合格3級。黃芩種子顏色有黑色和灰黑色的區別，但聚類結果發現，種子顏色與這4項評價黃芩質量的指標沒有必然聯系，可以認為黃芩種子質量與其顏色黑、灰黑無關。

圖1 黃芩種子4項指標系統聚類分析

4.4 單項指標K-均值聚類分析

通過K-均值聚類分析，界定黃芩種子分級指標的范圍，結果見表8。

表8 黃芩種子單項指標K-均值聚類分析結果

4.5 綜合分析結果

通過黃芩種子測定指標的相關性分析和主成分分析，確定黃芩種子質量等級劃分以發芽率和生活力為主要指標，千粒重和凈度為參考指標。同時采用系統聚類分析對黃芩種子進行等級數的界定，K-均值聚類分析對黃芩種子分級指標界定。通過綜合分析并結合實際生產情況，適當調整分級指標，初步制定黃芩種子質量等級劃分標準，結果見表9。分級方法采用最低定級原則，即任何一項不符合規定標準都不能定為相應等級的合格種子。

表9 黃芩種子質量分級標準

5 討 論

本研究發現，不同產地農戶自種自采的黃芩種子質量普遍低下，且不同產地之間質量差異明顯。不同來源的種子凈度和含水量存在顯著差異，反應了農戶對自種種子含水量控制和凈度處理比較隨意，導致種子凈度普遍偏低，種子干燥程度不一致，影響了種子壽命和播種量。筆者在實地取樣過程中發現，不同產地存在黃芩種子播種量不一致、出苗不齊的現象，推測不同產地間黃芩種子凈度、發芽率、發芽勢及生活力存在極顯著差異可能是導致上述現象的原因。研究發現，百粒法、五百粒法、千粒法3種方法均可用于黃芩種子千粒重的測定。不同來源黃芩種子千粒重存在極顯著性差異，主要集中在1.50～1.80 g之間，千粒重的差異可能是黃芩不同種質所決定的。黃芩種子顏色有黑色和灰黑色之別，分析發現，種子顏色的不同與反應黃芩種子質量的相關指標之間并無質量優劣的聯系，這與李小玲等[14]報道的黑色種子的質量顯著高于灰黑的種子，而黑色并帶有光澤的種子質量最好的觀點并不一致。筆者認為，黃芩種子顏色的差異不一定是其成熟度不同造成的，也可能是黃芩不同種質之間存在的差別。

在黃芩種子等級劃分過程中，利用統計軟件對測定指標進行了相關性分析和主成分分析，確定以發芽率、生活力、千粒重和凈度為分級指標。這與王峰偉等[10]、李云靜等[12]、李小玲等[14]報道的質量劃分標準的質量評價指標選擇有契合之處，反映了選定這4個指標作為種子等級劃分的合理性和普適性。本研究采用系統聚類分析進行等級數的界定，K-均值聚類分析進行分級指標范圍的界定。結合實際生產情況，初步制定黃芩種子質量等級劃分標準，該劃分方法科學、嚴謹、合理，可以作為黃芩種子質量標準劃分參考。在該標準下，10批樣品種子質量為優的種子有3份，分別為山西襄汾、山西陽城、陜西府谷；質量為良的有4份，分別為山西芮城、山西聞喜、甘肅隴西、甘肅宕昌；不合格種子有3份，分別為山東莒縣、山西夏縣和甘肅漳縣。按照李云靜等[12]制定的黃芩種子質量標準，該10批樣品中能達到一級的種子有4份，分別為山西襄汾、山西陽城、陜西府谷、甘肅隴西，其余均為二級種子。根據王峰偉等[10]制定的標準，沒有任何樣品種子能達到一級；二級種子有2份，分別為山西襄汾和陜西府谷；其余均為三級種子。李小玲等[14]以陜西商洛黃芩種子為材料建立了種子標準，在該標準下，收集到的10批樣品種子均未達到一級；二級種子有2份，分別為山西襄汾和陜西府谷；其余均為三級種子。從上述對比來看，在不同的分級標準之下，收集到的黃芩種子劃分的等級不一致，能夠達到優質種子標準的很少。這既反映所收集到的農戶自種自采種子質量低下的現狀，也反映了目前黃芩種子質量缺乏統一性好、普適范圍廣、科學合理的等級劃分標準。

優良的種子是提高藥材產量、質量和高品質優質藥材生產的前提。中藥材質量的穩定需要種子生產的標準化，包括良種選育、生產儲運、質量分級、檢驗規程等系列工程，其中首要任務就是種子質量標準的制定。本研究通過實地收集全國不同產地的黃芩種子，首次研究了不同產地農戶自種自采的黃芩種子質量差異；利用統計分析方法結合實際農戶生產情況，嘗試制定了種子質量等級標準，為后續黃芩種子質量評價及質量標準的研究提供了一定的參考依據；同時，對比已有的黃芩種子質量標準研究，發現黃芩種子質量標準的研究還需進一步完善，相關工作有待進一步深入系統的研究。