貴州茶樹藻斑病病原形態(tài)及DNA測序鑒定

(貴州大學，貴陽 550025)

茶藻斑病，又稱白藻病，是茶樹老葉病害之一。主要為害茶、油茶、山茶，其浸染多在中下部老葉片。貴州省此病害原來在茶園中鮮有發(fā)現(xiàn)，但在濕度較大環(huán)境中，野油茶的葉片上易出現(xiàn)癥狀。近年來，隨著貴州省茶葉種植規(guī)模的迅速擴大以及降雨量的增加，該病害在茶園中頻繁出現(xiàn)，并有發(fā)病不斷嚴重的趨勢。過去對該病害的鑒定主要是通過癥狀觀察，貴州省還沒有對該病害進行系統(tǒng)的研究，這將影響對該病害防治策略制定，不利于貴州省茶產業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。對此，本研究將采集于貴陽市花溪區(qū)和黔南州都勻市的茶樹藻斑病的標本進行形態(tài)學和DNA測序鑒定。

1 材料與方法

1.1 標本采集

在2017年2月初至2018年9月底，課題組對貴州省黔南州都勻市周邊螺螄殼、團山、斗篷山地區(qū)茶園以及貴陽市花溪黔陶鄉(xiāng)高坡茶園病害的發(fā)生情況進行調查，記錄各種病害癥狀并采集了具典型癥狀的病害標本。

1.2 病原菌的形態(tài)學觀察

將病害標本葉片先用無菌水清洗5～10 s，接著用75%的酒精清洗5～10 s，最后放入無菌水中清洗后，在無菌操作臺中晾干。用無菌刀片將病斑上的病原物刮下，以乳酚油為浮載劑制成玻片，再用Olympus BX 53顯微鏡(Japan)觀察病原的顯微結構特征，詳述并組制理想的圖版。同時對病原物的孢囊梗和孢子囊進行大小測量并求取平均值。

1.3 DNA的提取、PCR擴增及測序

1.3.1基因組DNA的提取

用BIOMIGA Fungus Genomic DNA Extraction Kit (GD 2416)試劑盒進行提取。

1.3.2PCR擴增

采用18 S通用引物(18 S-F/18 S-R)進行PCR擴增，1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度。

1.3.3DNA測序

對于瓊脂糖凝膠電泳檢測有雜帶的PCR擴增樣品，經(jīng)膠回收試劑盒純化后，選取pEASY-T 3 Cloning Vector進行目的片段的克隆和轉化后，由上海生工生物工程技術服務有限公司根據(jù)載體上的通用引物進行測序(M 13 F或M 13 R)。

1.4 DNA序列分析

應用Bioedit軟件檢測從測序公司獲得的序列是否準確，結果若顯示雙峰或雜峰，則序列準確性不可信，需重新擴增、測序。將峰值整齊的序列上傳到NCBI(National Center for Biotechnology Information)的BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)進行比對，確定其屬級分類地位。參考GenBank中的BLAST功能進行序列比對得到鑒定結果。

2 結果與分析

2.1 形態(tài)學觀察

病害癥狀：老葉上初生黃褐色針頭大的圓形小點，以后向四周放射狀擴展成圓形或近圓形病斑，大小0.5～1.0 mm，灰綠色至黃褐色，病斑上可見細條狀毛氈狀物。后期稍會形成隆起，變暗褐色，邊緣不整齊，表面平滑，有纖維狀紋理，有些時候病斑會形成穿孔 (圖1)。

形態(tài)特征：病原藻的營養(yǎng)體為葉狀體，由對稱排列的細胞組成。細胞長行，從中間向四周呈放射狀長出，病斑上的毛氈物是病原藻的孢子囊和孢囊梗。孢囊梗呈叉狀分枝，長250～500μm，頂端膨大，近圓形，頂端著生8～10個黃色至黃褐色的孢子囊，寬卵圓形，大小為(15～20)μm ×(16～20)μm(圖1)。該形態(tài)學與報道Pitaloka M.K[2]基本一致。

圖1 茶藻斑病癥狀及病原物寄生性紅銹藻形態(tài)特征

2.2 DNA測序

采用18 S通用引物(18 S-F/18 S-R)進行PCR擴增后將所獲DNA序列在NCBI-BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)里進行序列比對，發(fā)現(xiàn)序列與AY 220984[3]的同源性達100%，因此可認定為Cephaleurosvirescens。

3 討 論

關于茶藻斑病，因為前些年病害為害不重，僅在貴州省個別環(huán)境濕度比較大的油茶上觀察到。近年來，隨著貴州省茶葉種植面積的迅速增大，在部分地區(qū)的新老茶園均有發(fā)現(xiàn)。貴州省未見該病害的報道，特別是沒有該病害DNA序列信息的相關報道，不便于對該病害進行監(jiān)測及防治，本研究首次結合形態(tài)學和DNA測序技術對于茶藻斑病的病原菌進行了鑒定，并明確目前貴州省引起茶藻斑病的病原菌為寄生性銹藻(C.virescens)。