棉屬D基因組3個野生棉種Bet v 1基因鑒定及功能分析

董琪，Magwanga Richard Odongo，路普，蔡小彥，周忠麗，王省芬，王星星，許艷超，侯宇清，王艷情，王坤波，劉方*，馬峙英*

（1. 河北農業大學農學院/教育部華北作物種質資源研究與利用重點實驗室，河北 保定071001；2. 中國農業科學院棉花研究所/棉花生物學國家重點實驗室，河南 安陽455000）

Bet v1基因家族以樺樹花粉過敏原Bet v 1命名[1]，屬于植物病程相關蛋白PR10[2]，在雙子葉植物中分布廣泛。病程相關蛋白（Pathogenesis-related protein，PR）最初被描述為一類植物特異性蛋白質，因病原體的感染而積累[3]。進一步研究表明，多種生物和非生物脅迫能夠誘導PR 蛋白表達量升高[4-5]。PR10 是PR 蛋白中唯一的胞內蛋白，不含信號肽[6]。多項研究表明，多數PR10 蛋白是受真菌誘導表達的胞內多肽，能利用核糖核酸酶活性降解病原菌核酸殺死真菌[7]。Bufe等研究發現Bet v 1蛋白具有核糖核酸酶活性[8]，表明Bet v 1結構域對PR10 蛋白的抗真菌活性至關重要。

X 射線衍射和核磁共振顯示Bet v 1蛋白結構包含6個反向平行的β 折疊和3個α 螺旋[9]。Bet v 1蛋白質的三維結構存在1個大疏水空腔[10]，這種特殊結構使它有可能作為配體結合位點發揮作用，與具有重要生物學功能的激素、生物大分子和活性物質結合，調控Bet v 1蛋白在植物體內的活性或含量，從而調節植物對生物和非生物脅迫的耐受性[1]。研究人員鑒定出許多具有Bet v 1結構域的PR10 蛋白。張玉等利用底物法和濾紙片法研究證實煙草PR10 蛋白能夠有效抑制赤星病菌（Alternaria alternata）的活性[11]。煙草花葉病毒侵染辣椒后，辣椒CaPR-10 蛋白受到磷酸化修飾，分解入侵病毒RNA的核糖核酸酶活性顯著提高[12]。Liu等從牛茄子（Solanum surattense）中分離到SsPR10，未磷酸化的SsPR10 蛋白對牛茄子葉片總RNA 具有核糖核酸溶解活性，并能抑制稻瘟病菌（Pyricularia oryzae）的菌絲生長[13]。Xie等研究發現玉米ZMPR101 對丁香假單胞菌（Pseudomonas syringae）有較強的抑制作用[14]。Chadha等研究了花生AhPR10 對尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）和立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）的抑制作用，表明AhPR10 蛋白具有體外抗真菌活性[15]。研究人員在海島棉（Gossypium barbadense，Pima90-53，四倍體）中篩選到屬于9種PR 蛋白的50個基因，其中屬于PR10的基因可被黃萎病菌顯著誘導，并可能參與水楊酸信號通路的調節[16]，推測D 基因組野生棉Bet v1基因與棉花黃萎病抗性密切相關。

棉屬野生種由于環境差異和長期自然選擇，形成豐富的遺傳多樣性，具有許多優良性狀，如抗病蟲、抗寒、耐干旱、耐鹽堿等[17]，成為可被棉花育種應用的優異種質資源[18]，挖掘野生棉中的抗病基因資源應用于分子育種對控制棉花黃萎病的發生不失為一種有效措施[18]。雷蒙德氏棉（G.raimondii，D5）是D 基因組中唯一完成全基因組測序的棉種，為黃萎病菌侵染D 基因組野生棉的轉錄組進行有參分析奠定基礎[19]。前人采用蘸根接種法對8種野生棉的黃萎病抗性進行鑒定，結果表明戴維遜氏棉（G.davidsonii，D3-d）為感病棉種；索馬里棉（G.somalense，E2）、瑟伯氏棉（G.thurberi，D1）、異常 棉（G. anomalum，B1）、長 萼 棉（G.longicalyx，F1）、旱地棉（G.aridum，D4）和澳洲棉（G. australe，C3）為抗 病棉種；三裂棉（G.trilobum，D8）為高抗棉種[20]。本研究利用D 基因組二倍體棉種雷蒙德氏棉、三裂棉和瑟伯氏棉對響應病菌處理的潛在抗病基因進行深入挖掘。

雷蒙德氏棉全基因組測序的完成，為鑒定和發掘棉花D 基因組抗病基因，探究棉花抗病的分子機制提供了數據支持。植物Bet v 1家族成員具有的核酸酶活性能夠降解病原菌的遺傳物質，達到增強植物抗病性的目的。Bet v1基因在野生棉中尚未開展研究。本研究采用生物信息學手段在D 基因組中對Bet v1基因家族進行鑒定、基因結構分析、系統發育分析等。結合本課題已發表的D 基因組野生棉抗病轉錄組數據，進行雷蒙德氏棉、三裂棉和瑟伯氏棉黃萎病脅迫下家族成員表達的比較分析，以期為野生棉抗病相關基因挖掘提供參考，為抗病分子育種提供基因資源。

1 材料與方法

1.1 Bet v 1基因家族鑒定和序列分析

雷蒙德氏棉基因組數據下載自Phytozome（http://www.phytozome.net/）數據庫。從Pfam 32.0（http://pfam.xfam.org/）數據庫下載Bet v 1蛋白質保守結構域的隱馬爾可夫模型文件（PF00407），以PF00407 為探針，利用HMMER（http://hmmer.janelia.org/）軟件搜索雷蒙德氏棉蛋白質數據庫[21]，得到本家族候選成員。通過在線工具Pfam、CDD（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cg）和SMART（http://smart.embl-heidelberg.de/）驗證候選Bet v 1蛋白序列中存在的保守結構域。將最終得到的家族成員進行重新編號，利用工具ExPASy Server（http://web.expasy.org/computer_pi）預測蛋白質的相對分子質量和等電點。

1.2 染色體定位和亞細胞定位預測

根據雷蒙德氏棉Bet v1 家族基因的ID，在棉花功能基因組數據庫CottonFGD（https://cottonfgd.org/）進行搜索，確定Bet v1基因的染色體位置信息，利用軟件MapChart 2.2 繪制雷蒙德氏棉Bet v1基因的染色體定位圖。利用在線工具TargetP1.1（http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/）和Protein Prowler Subcellular Localization Predic tor version 1.2（http://bioinf.scmb.uq.edu.au:8080/pprowler_webapp_1-2/）進行Bet v 1家族成員的的亞細胞定位預測，并通過WoLF PSORT（https://wolfpsort.hgc.jp/）驗證預測結果。

1.3 系統發育和基因結構分析

為探究Bet v 1的系統發育關系，將鑒定的雷蒙德氏棉Bet v 1蛋白序列與分別來自Phyto zome（http://www.phytozome.net/）和TAIR（http://www.arabidopsis.org/）數據庫的可可（Theobromacacao）和擬南芥（Arabidopsis thaliana）的Bet v 1蛋白序列構建系統發育樹。采用ClustalW 對可可、擬南芥和雷蒙德氏棉的Bet v 1蛋白進行多重序列比對，利用MEGA6.0 軟件通過Neighbor-joining 法構建系統發育樹，Bootstrap=1 000。此外，通過基因組序列及編碼序列，利用Gene Structure Displayer Server（http://gsds.cbi. pku.edu.cn/）顯示Bet v1的基因結構。使用MEME（http://meme.sdsc.edu/meme/）鑒定雷蒙德氏棉Bet v 1蛋白的保守基序。

1.4 RNA-seq 分析3個棉種Bet v 1 家族基因的表達模式

本實驗室前期完成對雷蒙德氏棉、三裂棉和瑟伯氏棉（由中國農業科學院棉花研究所野生棉課題組保存）的黃萎病抗性鑒定。在強致病性菌系臨西2-1的處理下，瑟伯氏棉抗病，三裂棉和雷蒙德氏棉感病，其中雷蒙德氏棉病情指數（Disease index，DI）最低。隨后完成了3個棉種1 片真葉期經黃萎病菌處理0 h（接種相同體積PDA 培養基的對照組）、12h 和48h 根、莖和葉材料的轉錄組測序[22]，以雷蒙德氏棉基因組為參考基因組，獲得經黃萎病菌處理的3個D 基因組棉種的RNA-seq 數據。本研究從轉錄組數據中獲得3個棉種中Bet v1基因的FPKM 值（Fragments per kilobases of transcriptper per million fragments mapped），經log2FPKM 計算，利用TMeV 繪制熱圖。

1.5 棉花RNA 提取和基因表達分析

經黃萎病菌處理一葉期的雷蒙德氏棉、三裂棉和瑟伯氏棉，在0 h（接種相同體積PDA 培養液的對照組）、12h 和48 h分別取根、莖和葉組織樣品，速凍于液氮中。使用EASYspin Plus 植物RNA 快速提取試劑盒RN38（Aidlab Biotechnologies Co.，Ltd，Beijing，China）提取樣品RNA，通過瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop 2000 分光光度計檢測每個RNA 樣品的質量[23]。所有樣品均取0.5 μg RNA，使用TranScript-All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix（TransGen Biotech Inc.，Beijing，China）反轉錄試劑盒進行第一鏈cDNA合成。利用Primer Premier 5 設計Bet v1基因的特異引物（表1），以Gractin7（F：5'-ATCCTC-CGTCTA GACCTTG-3'；R：5'-TGTCCATCAGGCAACTCAT-3'）作為內參基因進行實時熒光定量聚合酶鏈式反應（Quantitative real time-polymerase chain reaction，qRT-PCR）分析，按照2-△△CT法計算基因的相對表達量。每個樣品具有3個生物學重復，并進行3 次技術重復。

表1 棉花Bet v 1基因qRT-PCR 分析的引物Table 1 Primers used in qRT-PCR analysis of the Bet v 1 genes in cotton

1.6 陸地棉Bet v 1基因功能驗證

本研究通過病毒誘導的基因沉默（Virus induced gene silencing，VIGS）體系干擾陸地棉Gh_D04G1399 基因表達。利用特異性引物（F：5'-GGAATTCCTCAGGCAGTCAAGAGCGT-3'；R：5'-CGGATCCGGGGTTAGCCAAGAGGTAA-3'）克隆基因359 bp 長的片段，通過EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位點插入煙草脆裂病毒（Tobacco rattle virus，TRV）載體pTRV2 中，構建35S 啟動子驅動的pTRV:Gh_D04G1399 重組載體，通過凍融法轉化農桿菌LBA4404 感受態細胞，以含有pTRV1 載體的LBA4404 菌液作為輔助菌。待棉花（晉棉20）幼苗子葉展開，真葉未長出時，通過注射法侵染棉花幼苗子葉，以pTRV:PDS（八氫番茄紅素脫氫酶基因）棉株作為陽性對照，未注射及注射空載體pTRV:00的棉株作為陰性對照。處理后的棉苗在24 ℃條件下黑暗處理24h 后，置于相對濕度大于60%、光周期為16h 光照/8 h黑暗的培養室進行培養。

pTRV:PDS 棉株葉片白化3 d 后，對pTRV:Gh_D04G1399、pTRV:00和野生型（Wild type，WT）進行黃萎病菌處理[24]。每株棉苗均勻傷根，缽底定量注射8 mL 孢子懸浮液（孢子含量1.2×107mL-1）。對照組接種相同體積的培養液。完成接種24h 后取樣，以Ghactin7（F：5'-ATCCTCCGTCTTGACCTTG-3'；R：5'-TGTCCGTCAGGCAACTCAT-3'）作為內參基因，利用TRV1 引物（F：5'-TTACAGGTTATTTGGGCTAG-3'；R：5'-CCGGGTTCAATTC CTTATC-3'），TRV2 引物（F：5'-TGTTTGAGGGAAAAGTAGAGAACGT-3'；R：5'-TTACCGATC AATCAAGATCAGTCGA-3'）和Gh_D04G1399 引 物（F：5'-CTCAGGCAGTCAA GAGCGTT-3'；R：5'-ATGTCCTCCAATCTGGTGCT-3'）進行半定量反轉錄聚合酶鏈式反應（Semi-qRT-PCR，SqRT-PCR），通過條帶密度檢測基因的擴增效率。以Ghactin7 為內參基因，利用Gh_D04G1399 引物進行qRT-PCR，用于目的基因相對表達量的檢測。接種黃萎病菌后15 d 和20 d時對發病情況進行記錄，并根據公式計算病情指數（Disease index，DI）：DI＝100×[∑（i×Ni）]/（4×N）。式中，i代表病級（0～4），Ni為i級幼苗數，N為幼苗總數[24]。

2 結果與分析

2.1 雷蒙德氏棉Bet v 1基因鑒定和序列結構分析

通過HMMER 搜索獲得的候選氨基酸序列，剔除不含Bet v 1的冗余序列，最終獲得59條序列。按其在染色體上的位置分布，依次命名為Bet v1-1～Bet v1-59。氨基酸序列理化性質分析結果（表2）表明：蛋白序列長度范圍在66（Bet v 1-18）～204個（Bet v 1-37）氨基酸殘基（aa），主要集中在122～178 aa，占89.8%（53個）。蛋白質的總平均親水性（GRAVY）值范圍為-0.562（Bet v 1-27）～0.333（Bet v 1-5），除Bet v 1-2、Bet v 1-5、Bet v 1-18、Bet v 1-23、Bet v 1-35 和Bet v 1-46外，其余53個蛋白質的GRAVY 值均為負數，表明多數家族成員為親水性蛋白。蛋白質相對分子質量范圍為7.064（Bet v 1-18）～23.221 kDa（Bet v 1-37），理論等電點范圍為4.232（Bet v 1-5）～9.146（Bet v 1-37）。除基因Bet v1-5 和Bet v1-18外，其他Bet v1基因均含有內含子（表2、圖1）。其中50個（84.7%）基因只含有1個內含子，6個（10.2%）基因含有2個內含子，內含子數目最多的基因為Bet v1-8（3個）。蛋白質基序分析顯示，Bet v 1蛋白質可分為3組（圖2）：第1組蛋白數量最多，基序包含motif 1、motif 2、motif 3、motif 4和motif 6；第2組包含motif2、motif5、motif6、motif7 和motif10；第3組則包括motif 6、motif 8和motif 9。結果表明，所有Bet v 1蛋白中較為保守的基序為motif 1、motif 2 和motif 6（圖2）。

圖1 雷蒙德氏棉Bet v 1基因系統發育樹和基因結構Fig. 1 Phylogenetic tree and gene structure of the Bet v 1 genes in G. raimondii

表2 雷蒙德氏棉基因組Bet v 1基因及其編碼序列信息、理化性質Table 2 Sequence information and physicochemical properties of Bet v 1 genes in the genomes of G. raimondii

表2 （續）Table 2 (Continued)

表2 （續）Table 2 (Continued)

圖2 雷蒙德氏棉Bet v 1蛋白保守基序預測Fig. 2 The prediction of conserved motifs of Bet v 1 proteins in G. raimondii

2.2 Bet v 1基因染色體和亞細胞定位

染色體定位分析顯示，除4個基因（Bet v1-56、Bet v1-57、Bet v1-58 和Bet v1-59）定位于scaffold 外，其余55個Bet v1基因分布在二倍體（D5）棉花基因組13條染色體中的8條（圖3）。染色體D501（Bet v1-1）與D507（Bet v1-34）上各有1個Bet v1基因，D503 上有2個基因（Bet v1-9和Bet v1-10），染色體D509 和D512 上各有3個基因，D502 上有6個基因，此外染色體D505 和D511 上帶有較多基因，各含有23個和15個。對Bet v 1 家族成員進行亞細胞定位預測，發現定位于細胞質的蛋白質占78.0%（46個），葉綠體、細胞骨架、胞外細胞器和細胞核各定位到4、3、3 和2個蛋白質，有1個蛋白質（Bet v 1-30）位于過氧化物酶體（表3），結果表明細胞質和葉綠體可能是Bet v 1蛋白質發揮功能的重要場所。

圖3 雷蒙德氏棉Bet v 1基因在染色體上的位置Fig.3 The chromosome location of the Bet v 1 genes in G. raimondii

2.3 Bet v 1家族系統發育分析

為探究雷蒙德氏棉Bet v1 家族的起源進化關系，本研究構建了雷蒙德氏棉、擬南芥和可可Bet v 1家族成員的系統發育樹（圖4）。將來自3個物種的Bet v 1蛋白質分為5個組（Group1～Group5），成員最多的為第5組，所有的擬南芥Bet v 1蛋白均聚于此組。第2組中的Bet v 1蛋白均來自雷蒙德氏棉。Bet v 1蛋白質顯示的聚類模式表明雷蒙德氏棉中的家族成員在自然界中具有一定的保守性。在整個系統發育樹中只檢測到1個同源基因對，即第4組的雷蒙氏棉和可可間基因Gorai.012G128600（Bet v1-53）和Thecc1EG008111，且第1組中2個物種Bet v 1蛋白表現出較高的相似性，顯示了棉花與可可較近的親緣關系。

表3 雷蒙德氏棉Bet v 1基因染色體和亞細胞定位Table 3 Chromosome and subcellular localization of the Bet v 1 genes in G. raimondii

表3 （續）Table 3 (Continued)

表3 （續）Table 3 (Continued)

圖4 雷蒙德氏棉、擬南芥和可可Bet v 1蛋白系統發育樹分析Fig. 4 Phylogenetic tree analysis of Bet v 1 proteins from G. raimondii, A. thaliana and T. cacao

2.4 3個棉種Bet v 1基因的表達模式分析

為進一步了解Bet v1 在增強棉花對黃萎病抗性方面的潛在作用，利用課題前期完成的黃萎病菌脅迫下3個D 基因組野生棉雷蒙德氏棉、三裂棉和瑟伯氏棉的轉錄組數據進行基因差異表達分析。雷蒙德氏棉中共有45個Bet v1基因存在差異表達（圖5）。根據基因表達模式將雷蒙德氏棉Bet v1 家族基因分為3組。其中第1組的10個基因下調表達；第2組基因數量最多，共22個，該組基因表達差異較小，如Bet v1-11（Gorai.005G062500）除在葉片中輕微下調表達，在根和莖中未見明顯的差異表達；第3組中的13個基因高度上調表達，如Bet v1-27（Gorai.005G156800）和Bet v1-54（Gorai.012G129000）在根、莖、葉中均高度上調表達（圖5A）。依據參考基因組，三裂棉和瑟伯氏棉轉錄組測序結果中分別鑒定到44 和45個Bet v1基因。2個棉種的表達譜具有與雷蒙德氏棉相似的基因表達模式，同樣可分為3組。第3組均高度上調表達（圖5B和圖 5C），如三裂棉中Bet v1-6（Gorai.002G177600）、Bet v1-54（Gorai.012G129000）和Bet v1-55（Gorai.012G135200），瑟伯氏棉中Bet v1-6（Gorai.002G177600）和Bet v1-54（Gorai.012G129000），在根、莖和葉組織均優勢表達。

圖5 黃萎病菌脅迫下Bet v 1基因轉錄組表達量熱圖Fig. 5 Heatmap of transcriptome expression of Bet v 1 gene under the stress of V. dahliae

為驗證RNA-seqBet v1基因表達模式中第3組基因表達量的準確性，本研究從中篩選13個Bet v1基因進行qRT-PCR 驗證（圖6）。與提供參考基因組的雷蒙德氏棉相比，黃萎病菌在三裂棉和瑟伯氏棉中誘導更多Bet v1基因上調表達，例如Bet v1-6（Gorai.002G177600）、Bet v1-28（Gorai.005G160700）和Bet v1-27（Gorai.005G156800）分別在雷蒙德氏棉根、莖和葉中下調表達，而在三裂棉和瑟伯氏棉的不同組織中均上調表達。本研究在3個棉種的qRT-PCR 分析中發現基因Bet v1-54（Gorai.012G129000）在不同組織樣品中均表現高度上調表達，qRT-PCR 相對表達量與3個棉種的轉錄組表達水平一致，推斷該基因在棉花抗黃萎病中發揮重要功能。

圖6 黃萎病菌脅迫下Bet v 1基因qRT-PCR 相對表達量熱圖Fig. 6 Heatmap of qRT-PCR relative expression of Bet v 1 gene under the stress of V. dahliae

2.5 陸地棉Bet v 1基因VIGS 功能驗證

通過TRV 誘導沉默陸地棉（晉棉20）中Bet v1-54（Gorai.012G129000）的同源基因Gh_D04G1399（相似性99.58%，圖7）。注射TRV:PDS菌液的陽性對照植株2 周后新葉出現白化表型（圖7A），表明TRV 能夠有效沉默植株中的靶基因。通過SqRT-PCR 驗證目的基因Gh_D04G1399的沉默效果（ 圖 7B），發現沉默（TRV:Gh_D04G1399）植株與野生型（WT）、陰性對照（TRV:00）相比，目的基因經SqRT-PCR 后條帶亮度較弱。此外，利用qRT-PCR 檢測野生型、陰性對照和沉默植株中目的基因Gh_D04G1399的表達水平（圖7D）?？瞻讓φ战M（CK）中，沉默植株的目的基因表達水平分別是野生型和陰性對照的24.6%和21.9%；黃萎病菌處理后，目的基因高度上調表達，但沉默植株目的基因的表達同樣受到有效抑制（野生型的35.2%，陰性對照的36.1%）。表明目的基因Gh_D04G1399 被有效沉默。觀察棉株的表型特征，對照組中陰性對照和野生型植株沒有明顯的生長差異（圖7C），表明未插入靶基因的TRV 對植株的正常生長沒有影響。黃萎病菌處理后，野生型和陰性對照植株變化差異較小，但沉默植株發病嚴重，葉片失綠嚴重，出現枯萎（圖7C）。病情調查結果（圖7E）顯示：沉默植株的病情指數（15 d 為25.8，20 d 為40.8）顯著高于陰性對照（15 d 為11.1，20 d 為15），目的基因的沉默嚴重影響棉株對黃萎病菌的抵抗能力，表明Gh_D04G1399 具有提高棉花黃萎病抗性的功能。

圖7 VIGS 分析黃萎病脅迫下棉花Gh_D04G1399 基因功能分析Fig. 7 Function analysis of Gh_D04G1399 in cotton by VIGS under Verticillium wilt stress

3 討論

黃萎病嚴重影響棉花的產量和纖維品質，棉花野生資源具有較強的抗病特性，研究其抗病性并從中挖掘抗病相關基因，對培育高抗黃萎病的棉花品種具有重要意義。本研究通過對野生棉種雷蒙德氏棉（D5）進行基因組分析，從中鑒定出59個Bet v1基因。多數Bet v1基因含有內含子。高等植物中內含子的可變剪輯能夠調節基因的時空表達，此外還會影響基因表達的啟動、基因的表達模式和表達水平的增強等[25]。因此，大多數脅迫響應基因都具有內含子，例如棉花MATE基因、CDK基因和LEA基因[26-28]。本研究發現Bet v1基因分布于D 基因組13條染色體中的8條。棉花簡單重復序列（Simple sequence repeat，SSR）的研究中，在染色體上一般沒有明確的分布模式，極少表現為平均分布[29]。通過研究Bet v1基因在D 基因組染色體的分布，推測Bet v1基因與染色體可能具有特異的對應關系。

本課題前期完成了雷蒙德氏棉（感病，DI：55.00）、三裂棉（感病，DI：40.83）和瑟伯氏棉（抗病，DI：15.00）的室內黃萎病抗性鑒定。黃萎病菌脅迫下3個棉種的Bet v1基因表達趨勢與其抗病水平一致，推測此類基因在增強棉花的黃萎病抗性方面起到了關鍵作用。本研究根據Bet v1基因的表達水平，將其分成3組。第1組和第2組基因在各時間點表達量較低，推測該部分基因不被黃萎病菌誘導表達，在棉花抗病過程中作用較小。第3組基因在轉錄組分析中顯示高表達，其中三裂棉屬于第3組基因數量最多，瑟伯氏棉屬于第3組基因的表達量更高，暗示不同棉種中Bet v1基因間的差異導致其在生物脅迫中的效用發生變化。經qRT-PCR 驗證后，發現基因的表達水平與3個棉種對黃萎病的抗病水平一致，進一步說明瑟伯氏棉的對黃萎病的抗性較強。結合RNA-seq 和qRT-PCR 分析顯示基因Bet v1-54（Gorai.012G129000）在3個棉種中高度上調表達，推測該基因在棉花抗黃萎病中發揮重要作用。亞細胞定位預測Bet v 1-54 定位于葉綠體。已知高等植物葉綠體在生物脅迫中的作用已被廣泛研究，許多生物脅迫誘導表達的蛋白質存在于葉綠體中，如Belhaj等證明葉綠體蛋白RPH1 能夠顯著增強擬南芥對油菜疫霉（Phytophthora brassicae）的抗性[30]。Zhao等發現轉基因煙草中葉綠體靶向蛋白DnaJ 過表達賦予了煙草耐旱性和對青枯假單胞菌（Pseudomonas solanacearum）的抗性[31]。通過VIGS 技術對Gh_D04G1399 基因進行功能分析，發現基因沉默植株黃萎病發病更嚴重，表明其表達限制黃萎病菌的侵染。根據研究者關于PR10 蛋白的研究，推測Bet v1基因受JA/SA 信號通路的調控，以磷酸化/去磷酸化為反應開關，通過核酸酶活性降解病原菌核酸，從而增強棉花的抗病性[32]。

4 結論

野生棉種中具有提高棉花生物脅迫和非生物脅迫耐受性的潛在基因資源，利用這些野生種質，有助于突破遺傳基礎狹窄、遺傳多樣性喪失在現代棉花育種中的限制。本研究在雷蒙德氏棉D5基因組中鑒定到59個Bet v1基因，分布于8條染色體，78%的Bet v 1蛋白質定位于細胞質，96.6%的基因具有內含子，利用系統發育分析將這些基因分為5組。黃萎病菌脅迫下，雷蒙德氏棉、三裂棉和瑟伯氏棉中基因表達水平與其抗病趨勢一致，根據表達水平將Bet v1基因分為3組，其中第3組基因響應生物脅迫高量表達。Bet v1-54 在不同組織樣品中均優勢表達。與陰性對照相比，VIGS 沉默Gh_D04G1399 基因的棉株發病更重，表明響應黃萎病菌侵染的Bet v1家族基因可能具有增強棉花耐黃萎病的特性。本研究對發掘野生棉種的潛在抗病資源及棉花抗病遺傳改良具有參考價值。