豬鏈球菌4型轉錄調控因子GalR的生物學特性

孫珂，祝昊丹，何孔旺，王丹丹，周俊明，俞正玉，呂立新，倪艷秀

豬鏈球菌4型轉錄調控因子GalR的生物學特性

孫珂1,2，祝昊丹1，何孔旺1，王丹丹1，周俊明1，俞正玉1，呂立新1，倪艷秀1

（1江蘇省農業科學院獸醫研究所，南京 210014；2吉林農業大學動物科學技術學院，長春 130118）

【】研究分析豬鏈球菌4型（serotype 4,SS4）強毒株SH1510 轉錄調控因子GalR基因的缺失對細菌生物學特性的影響，為進一步研究GalR對半乳糖代謝途徑的調控及其致病機理提供理論依據。利用同源重組雙交換的方法構建了SS4強毒株SH1510 轉錄調控因子GalR基因缺失株SH1510Δ，通過GalR基因內部擴增引物I1/I2進行缺失株初步篩選，進一步通過PCR和Western blotting鑒定缺失株SH1510Δ。對親本株SH1510和缺失株SH1510Δ進行革蘭氏染色以比較形態差異；配置基礎培養基，分別加入葡萄糖、蔗糖、D-半乳糖后培養細菌，繪制細菌生長曲線，比較細菌對不同糖的利用率；將親本株和缺失株的菌液濃度分別調整為2.5×109、5×108、1×108、2×107CFU/mL，對BALB/c小鼠進行腹腔注射以觀察小鼠致死率并使用Reed-Muench法計算菌株LD50。將濃度為2×107CFU/mL的親本株和缺失株1﹕1等體積混合后腹腔注射BALB/c小鼠，24 h后取腦、脾、血在氯霉素抗性和無抗性THB平板上進行細菌計數，比較細菌在小鼠體內的定植能力；并以健康豬的全血模仿體內環境，將親本株和缺失株分別加入含有SS4抗血清的健康豬全血中，37℃孵育2 h進行平板計數，比較細菌在全血中的存活能力。使用內部檢測引物I1/I2做PCR，缺失株SH1510Δ檢測為陰性，進一步使用引物C1/C2、O1/C2、O2/C1、O1/O2鑒定缺失株SH1510Δ，分別擴增出1 056、2 121、2 094、3 147 bp的片段，結果和預期相符。Western blotting 鑒定結果表明親本株SH1510可與粗制GalR多抗兔血清發生特異性結合，在37 kD處出現單一條帶，但缺失株SH1510Δ沒有條帶出現。PCR和Western blotting鑒定結果均表明缺失株SH1510Δ已構建成功。親本株和缺失株經革蘭氏染色，光學顯微鏡下觀察可見親本株和缺失株均呈鏈狀排列，長度相似，形態無顯著差異。在葡萄糖和蔗糖作為唯一糖原的生長條件下，親本株和缺失株的生長情況相仿，而當糖原為D-半乳糖時，缺失株的生長速率和OD600值明顯低于親本株。另外，從最高OD600值可以看出，豬鏈球菌SH1510對糖的利用率為葡萄糖＞蔗糖＞D-半乳糖。 小鼠致病性試驗中，親本株和缺失株的LD50分別為1×108CFU和1.62×108CFU，缺失株對小鼠的致病性下降了1.62倍。體內競爭感染試驗結果顯示，缺失株在小鼠的腦、脾、血液中的細菌分離數均遠低于親本株，差異極顯著（＜0.01）。全血存活試驗表示，親本株的存活率為35.2%，缺失株的存活率為27.3%，缺失株SH1510Δ比親本株SH1510在全血中的存活率顯著下降（＜0.05）。GalR 基因可促進豬鏈球菌4型對半乳糖的利用，同時對SH1510的毒力有直接或間接的調控作用。

豬鏈球菌4型；GalR；生物學特性；毒力

0 引言

【研究意義】細菌對環境的改變必須做出迅速的反應，營養的供給隨時都可以發生變化，反復無常，要能得以幸存必需具有可以變換不同代謝底物的能力，細菌代謝與調控型因子可以讓細菌更好的應對環境變化，幫助細菌生存和感染，所以對細菌代謝調控基因的研究有利于細菌致病機制的闡明。【前人研究進展】豬鏈球菌（）是一種重要的豬病原菌，可導致豬關節炎、敗血癥、心內膜炎、腦膜炎、肺炎等病癥，也可導致畜牧與獸醫相關從業人員的發病及死亡[1-3]。根據細菌莢膜抗原，豬鏈球菌可分為33個血清型（1-31型，33型和1/2型），其中，豬鏈球菌2型被公認為是致病性最強血清型[4-6]。另外，在亞洲國家也經常出現3，4，5，7，8，1/2血清型[7-10]；加拿大經常分離出3，4，8，22，1/2血清型[11]。豬鏈球菌4型（type 4，SS4）也是一種致病血清型，可導致人和動物發病甚至死亡。1968—1984年，荷蘭分離出30株引起人腦膜炎的豬鏈球菌菌株，其中1株為SS4[12]。2009—2012年，泰國在患有豬鏈球菌病的人群中分離出了668株豬鏈球菌，血清型比例SS4為0.15%[13]。2001年，HAN于韓國不同生豬屠宰場406份扁桃體中分離出55株豬鏈球菌，SS4占5.5%[14]。PRUFER[15]將1996—2016年間從德國分離的711株豬鏈球菌進行血清學分型，結果1996—2004年間的189株分離株中出現19個豬鏈球菌血清型，其中SS4占10%；2015—2016年間的522株分離株中出現23個豬鏈球菌血清型，SS4占10.3%；將研究結果與豬鏈球菌的臨床背景聯系起來，SS4經常分離自具有呼吸道疾病和中樞神經系統疾病的患病豬，證明SS4可引起肺病和腦膜炎；將結果與毒力因子結合分析，SS4分離菌株高頻率攜帶毒力因子mrp和sly。CHATURVEDI[16]等用4周齡仔豬為動物模型評價SS4的毒力，結果導致仔豬死亡。近幾年來，在中國健康豬場和發病豬場均經常分離到SS4，且分離率逐漸上升[17]，王娟[18]對2011—2014年間在廣東省不同地區發病豬場分離的58株豬鏈球菌進行血清學分型，SS4血清型比例為3.45%。周明瑤[19]在蘇南地區某健康豬場80份鼻拭子中檢測到豬鏈球菌4型竟高達46.25%，這證明豬鏈球菌4型在我國某些地區已成為優勢血清型，嚴重威脅豬群健康。當前，國內外對豬鏈球菌的研究主要集中在豬鏈球菌2型上[20]，對SS4的研究較少，范圍僅限于血清型分型PCR鑒定，對SS4毒力因子的研究還沒有報道。江蘇省農業科學院畜牧獸醫研究所實驗室前期通過比較蛋白組學分析豬鏈球菌4型強弱毒株的菌體蛋白表達譜，篩選到了16個差異表達蛋白，其中包括轉錄調控因子。GalR是參與半乳糖轉運和代謝的調控蛋白[21]。在大腸桿菌中，GalR可調控D-半乳糖代謝途徑相關基因galETKM、galP、galS、mglBAC的轉錄[22]。肺炎鏈球菌中，在半乳糖作為糖源的生長環境下，是維持正常生長所必須的基因，轉錄因子可作為的轉錄激活因子，促進半乳糖的代謝[23]。【本研究切入點】GalR蛋白是SS4強弱毒株中顯著差異表達蛋白之一，推測其可能與SS4的致病性相關。因此，通過同源重組的方法構建了SS4強毒株SH1510的GalR基因缺失株SH1510Δ，對其生物學特性進行比較，包括細菌的形態、生長特性、糖的利用率、在豬全血中的存活能力及對BALB/c小鼠的致病性。【擬解決的關鍵問題】轉錄調控因子對豬鏈球菌4型強毒株SH1510半乳糖代謝及毒力的影響。

1 材料與方法

試驗于2017年12月至2018年12月在江蘇省農業科學院獸醫研究所完成。

1.1 菌種和質粒

豬鏈球菌4型強毒株SH1510，2015年分離自上海病豬肺臟，由江蘇省農業科學院獸醫研究所保存。pR326質粒（氯霉素抗性）由江蘇省農業科學院獸醫研究所試驗室保存。溫敏性自殺質粒pSET4s（豬鏈球菌-大腸桿菌穿梭質粒，壯觀霉素抗性）由Takamatsu[24]惠贈。缺失株SH1510Δ（氯霉素抗性）自建。大腸桿菌DH5α化學感受態細胞購自南京諾唯贊生物科技有限公司。

1.2 培養基

THB液體培養基按照說明書，3%THB粉狀成品配制；THB固體培養基是在THB液體培養基的基礎上加入1.5%的瓊脂粉制成。THY液體培養基是在THB液體培養基的基礎上加入2%的酵母提取物制成。基礎培養基配方為5.0 g·L-1氯化鈉、2.5 g·L-1磷酸氫二鈉、3.5%胰蛋白胨、0.04 g·L-1對氨基苯甲酸、0.2 g·L-1VB1、0.2 μg·L-1VB2、1 μg·L-1VB3。

1.3 主要試劑與儀器

PCR Thermal Cycler Dice TP-600 ( 日本Takara )；THB（美國BD公司）；2 x Taq PCR Mix、DL 2000 marker、DL 5000 marker（東盛生物科技有限公司）； MiniBEST DNA Fragment Purification ( 日本Takara )；DNA Ligation Kit（日本Takara）。

1.4 引物

試驗所設計的引物序列詳情見表1。L1/L2，R1/R2分別擴增GalR編碼基因的上下游同源臂基因序列；C1/C2擴增氯霉素抗性基因；I1/I2 擴增GalR基因的ORF內部基因序列（用于缺失株的初步篩選）；在GalR基因上下游同源臂外部設計一對引物O1/O2，擴增包括GalR基因、上下游同源臂基因及其外部的一段基因序列的總長（用于外部檢測）。

表1 引物序列

1.5 缺失株SH1510ΔGalR的構建

1.5.1 基因缺失質粒pSET4s::GalR的構建 基因缺失質粒pSET4s::GalR的構建如圖1所示，使用引物L1/L2、R1/R2及SH1510 DNA模板擴增出GalR編碼基因的上下游同源臂基因，使用引物C1/C2及pR326質粒為模板擴增氯霉素抗性基因。各擴增產物使用MiniBEST DNA Fragment Purification進行純化回收，通過限制性內切酶對純化后的DNA片段進行酶切，然后將酶切后的各產物進行純化。最后利用DNA Ligation Kit，將3個片段以上游同源臂、氯霉素抗性基因、下游同源臂的順序依次連接到pSET4s載體上，其間每一步通過轉化進大腸桿菌DH5α進行大量克隆。每一步連接過后的質粒送上海英濰捷基生物有限公司進行測序，以確保質粒構建的準確性。

圖1 SH1510ΔGalR缺失株的構建示意圖

1.5.2 電轉化 本試驗參照Takamatsu的方法制備SH1510感受態細胞[24]。分別取4、5、6、7、8 μL pSET4s::GalR缺失質粒加入80 μL SH1510感受態細胞輕柔混勻，將混合物轉移進已預冷的電擊杯當中，冰浴30 min, 然后進行電轉化，電轉參數為2.35 kV·cm-1、200 Ω和25 μF，加入900 μL THY液體培養基吹打混勻，將混合物轉移至3 mL THY液體培養基中，28℃搖床培養至OD600為0.4左右，吸取100 μL菌液涂布于雙抗THY平板（壯觀霉素100 μg·mL-1，氯霉素12.5 μg·mL-1），28℃培養24 h后挑單菌于5 mL THY液體培養基（氯霉素12.5 μg·mL-1）中，菌液生長至OD600值為0.4左右，轉移試管于37℃搖床繼續培養4—6 h，菌液倍比稀釋后涂布于單抗THY平板（氯霉素12.5 μg·mL-1），37℃培養24 h。

1.5.3 缺失株的篩選與鑒定 挑取200個單菌進行增菌培養，吸取1 mL菌液制成DNA模板，使用內部檢測引物I1/I2進行缺失株初步篩選，鑒定為陰性的菌株，進一步使用引物C1/C2，O1/C2，O2/C1，O1/O2進行鑒定，并將擴增的陽性片段送上海英濰捷基生物有限公司測序，測序結果通過比對進行驗證。

1.5.4 Western blotting 鑒定 將親本株SH1510和缺失株SH1510Δ按2%比例接種進3 mLTHB液體培養基，過夜培養后，8 000 r/min離心 10 min，棄上清，菌體沉淀使用100 μLPBS重懸，加入25 μL蛋白上樣緩沖液，100℃煮沸10 min，進行SDS-PAGE。半干轉印法轉移蛋白至PVDF膜，5%脫脂乳進行過夜封閉，次日棄掉脫脂乳，TBST洗滌4次，粗制GalR多抗兔血清（1﹕400）為一抗，室溫孵育2 h，TBST洗滌4次，HRP-羊抗兔IgG（1﹕10 000）為二抗，室溫孵育1 h，TBST洗滌4次，ECL顯色。

1.6 革蘭氏染色

將凍存的親本株SH1510和缺失株SH1510Δ平板劃線進行復蘇，挑取親本株和缺失株的單菌落分別接種于THB肉湯中，200 r/min，37℃振蕩培養至對數生長期，將親本株SH1510和缺失株SH1510Δ進行涂片、革蘭氏染色和鏡檢，在油鏡鏡頭下觀察并比較兩株菌的形態。

1.7 不同糖利用率的比較

參照文獻[25]的方法配制基礎培養基，試驗配制六瓶基礎培養基，兩瓶為一組，分別加入10 mmol·L-1葡萄糖、蔗糖和D-半乳糖。復蘇細菌，挑取親本株SH1510和缺失株SH1510Δ的單菌落分別接種于THB肉湯中，200 r/min，37℃振蕩培養至OD600=0.7，12 000 r/min離心10 min，棄上清，用滅菌生理鹽水洗滌菌體2次，等體積重懸細菌。將親本株和缺失株的菌液按1%的比例加入3組培養基中，每隔1 h，測定OD600值，直到細菌OD600值到達穩定方可停止，試驗重復3次，計算每小時OD600平均值以繪制生長曲線。

1.8 小鼠致病性試驗

細菌經復蘇后，挑取親本株SH1510和缺失株SH1510Δ的單菌落分別接種于THB肉湯中，200 r/min，37℃振蕩培養至對數生長期，12 000 r/min離心10 min，棄上清，用滅菌生理鹽水洗滌菌體2次，調整菌液濃度為2.5×109、5×108、1×108、2×107CFU/mL。將BALB/c 小鼠隨機分成8組，每組10只，每只小鼠腹腔注射1 mL菌液；另設對照組10只，每只腹腔注射1 mL無菌生理鹽水。注射后每天觀察并記錄小鼠的臨床表現和死亡情況，連續觀察7 d。用Reed-Muench法計算出菌株對BALB/c 小鼠的LD50。

1.9 體內競爭感染試驗

根據上述方法將親本株SH1510和缺失株SH1510Δ的菌液濃度均調整為2×107CFU/mL。按照1﹕1的比例混合兩菌液。試驗小鼠共5只，每只小鼠腹腔注射1 mL混合菌液。攻毒24 h后，每只小鼠均取腦、脾、血放入破碎管中，加入PBS使用勻漿機將其破碎，倍比稀釋后分別涂布無抗THY平板和單抗THY平板（氯霉素12.5 μg·mL-1），涂布的平板設置3次重復，37℃過夜培養后進行平板計數。其中，無抗平板上長的菌落數為親本株和缺失株菌落數的總和，單抗平板上長的菌落數為缺失株菌落數，親本株的菌落數等于無抗平板菌落數減去單抗平板菌落數。

1.10 全血存活試驗

采集健康豬血，經酶聯免疫試驗檢測血清中SS4抗體為陰性。培養親本株SH1510和缺失株SH1510Δ菌液，OD600至0.6—0.8之間，12 000 r/min離心10 min，棄上清，用滅菌生理鹽水洗滌菌體2次，調整菌液OD600至0.1。取1 mL全血、300 μL SS4抗血清、100 μL菌液進行混勻，37℃溫箱孵育2 h。分別在0、2 h取孵育混合物，倍比稀釋涂布THY平板，過夜培養后進行細菌平板計數。設定0 h孵育混合物的細菌平板計數結果為100%標準，計算2 h細菌全血中存活百分比。

2 結果

2.1 缺失株SH1510ΔGalR的PCR鑒定

缺失株SH1510Δ的PCR鑒定結果見圖2，使用內部檢測引物I1/I2做PCR，親本株擴增出723 bp的片段，缺失株為陰性；使用氯霉素抗性基因檢測引物C1/C2做PCR，親本株為陰性，缺失株擴增出1 056 bp的片段；使用O1/C2和O2/C1進行交叉PCR檢測，引物O1/C2檢測親本株為陰性，缺失株擴增出2 121 bp的片段，引物O2/C1檢測親本株同為陰性，缺失株擴增出2 094 bp的片段；使用外部檢測引物O1/O2做PCR，親本株擴增出2 826 bp的片段，缺失株擴增出3 147 bp的片段。以上結果表明缺失株SH1510Δ構建成功。

2.2 Western blotting 鑒定

Western blotting 鑒定結果可見圖3，親本株SH1510可與粗制GalR多抗兔血清發生特異性結合，在37 kD處出現單一條帶。缺失株SH1510Δ不能發生反應，沒有條帶出現，結果表明缺失株SH1510Δ構建成功。

2.3 革蘭氏染色

在圖4中可以看出兩株菌均呈圓形或卵圓形，鏈狀排列，長度相似，無明顯差異。

M：DNA分子質量標準；1、3、5、7、9：菌株SH1510；2、4、6、8、10：菌株SH1510ΔGalR。1、2：引物I1/I2；3、4：引物C1/C2；5、6：引物O1/C2；7、8：引物O2/C1；9、10：引物O1/O2

M：蛋白分子質量標準；1：SH1510菌株；2：SH1510ΔGalR菌株

2.4 不同糖利用率的比較

由圖5可見，在葡萄糖和蔗糖作為唯一糖原的情況下，親本株和缺失株的生長情況相仿；在D-半乳糖作為唯一糖原的情況下，缺失株的生長速率和OD600值明顯低于親本株；同時，從最高OD600值可以看出，豬鏈球菌SH1510對糖的利用率為葡萄糖＞蔗糖＞D-半乳糖。

A：菌株SH1510（1000×）；B：菌株SH1510ΔGalR（1000×）

2.5 BALB/c小鼠致病性試驗

攻毒過后，BALB/c小鼠表現嗜睡，不食或少食，膿眼等臨床癥狀并發生死亡，對照組小鼠無異常表現。兩菌株對BALB/c小鼠的致死率和半數致死量LD50見表2。結果可知，缺失株SH1510Δ的LD50（1.62×108CFU）是親本株SH1510 LD50（1×108CFU）的1.62倍，缺失株SH1510Δ比親本株SH1510的BALB/c小鼠致病力下降1.62倍，可見轉錄調控因子GalR基因和豬鏈球菌SH1510的毒力有關。

2.6 內競爭感染試驗

攻毒后觀察到小鼠出現嗜睡、膿眼、跛行等發病癥狀，采集小鼠腦、脾、血液進行處理，處理后分別在無抗THY平板和單抗THY平板（氯霉素12.5 μg·mL-1）上進行細菌計數，結果如圖6所示，在BALB/c小鼠腦、脾和血液當中，親本株的菌落數均遠高于缺失株菌落數，差異極顯著（＜0.01）。體內競爭感染試驗結果表明基因缺失后，細菌在體內的定植能力顯著減弱。

2.7 全血存活試驗

全血存活試驗結果見圖7，2 h后，親本株SH1510的存活率為35.2%，缺失株SH1510ΔR的存活率為27.3%，缺失株SH1510Δ比親本株SH1510在全血中的存活率下降顯著（＜0.01）。全血存活試驗結果表明GalR基因缺失后，細菌在全血中的存活能力顯著下降。

A,葡萄糖；B,蔗糖； C,D-半乳糖 A, glucose; B, sucrose; C,D-galactose

A. 血液；B. 腦；C. 脾A. Blood; B. Brain; C. Spleen

表2 BALB/c小鼠致死率和半數致死量

*分子表示每組小鼠死亡數，分母表示每組小鼠總數

The molecules represent the number of deaths in each group of mice and the denominator represents the total number of mice in each group

圖7 親本株和缺失株在全血中的存活能力

3 討論

后基因組時代，基因敲除是研究目的基因功能的經典分子生物學技術[26]，同源重組構建目的基因缺失株的方法在豬鏈球菌毒力因子的相關研究中得到廣泛應用[27]，通過構建目的基因缺失株，進一步研究并分析親本株和缺失株生物學特性的差異，由此可鑒定目的基因的特定功能。

轉錄調控因子屬于LacI家族，LacI家族的轉錄調節因子主要參與調節糖的分解代謝途徑（例如，利用乳糖、半乳糖、果糖、葡萄糖、麥芽糖等的途徑）[28]。在大腸桿菌和肺炎鏈球菌中，具有調控半乳糖代謝基因轉錄的功能[22-23]。在豬鏈球菌中的功能尚未得到證實，所以通過構建缺失株來鑒定的功能。通過革蘭氏染色觀察到兩株菌均呈圓形或卵圓形，鏈狀排列，長度相似，無明顯差異，這項結果表明不是細菌維持基本形態的必要基因。親本株和缺失株對不同糖的利用率試驗，在葡萄糖和蔗糖作為唯一糖原的情況下，兩株菌的生長情況相仿，缺失株在兩種利用率較高的糖環境下均能正常生長，在D-半乳糖作為唯一糖原的情況下，的缺失導致豬鏈球菌SH1510的生長速率和OD600值降低，這表明可促進細菌對半乳糖的利用。Afzal[23]研究表明，在肺炎鏈球菌中，可作為半乳糖激酶編碼基因的轉錄激活因子，從而促進半乳糖代謝，因此推測在豬鏈球菌中，轉錄調節因子很可能具有相似的功能。

BALB/c小鼠致病性結果顯示，親本株SH1510的 LD50為1×108CFU，缺失株SH1510Δ的LD50為1.62×108CFU，缺失株對小鼠的致病性下降了1.62倍。這項結果直接表明SH1510菌株GalR基因和SS4毒力相關。在豬鏈球菌的疾病感染過程中，豬鏈球菌首先需要粘附和侵襲上皮細胞，然后進入血液抵抗中性粒細胞和巨噬細胞的吞噬和殺傷而存活，后隨血液循環侵入各組織臟器，引發敗血癥，導致全身感染，由此可見豬鏈球菌在全血中的存活能力對細菌的致病性極為重要[29-30]。全血存活試驗中，缺失株SH1510Δ比親本株SH1510在全血中的存活率顯著下降（＜0.05）。體內競爭感染試驗表明在小鼠腦、脾和血液中，親本株的菌落數均遠高于缺失株菌落數，差異極顯著（＜0.01），這說明GalR基因缺失后，缺失株在體內臟器的定植能力和存活能力都遠低于親本株，豬鏈球菌必須通過血液循環系統才能入侵各個臟器從而導致全身感染，缺失株SH1510Δ在全血中的存活能力顯著低于親本株，所以臟器中缺失株的分離數量才遠低于親本株，由此可見兩項試驗結果密切相關。

這是在我國首次開展對豬鏈球菌4型毒力因子的研究，也是首次對轉錄調控因子致病性方面的研究，研究表明不但參與半乳糖的代謝與分解，而且對豬鏈球菌4型的毒力有直接或間接的調控作用。為進一步探索對半乳糖代謝途徑的調控及其致病機理提供一定的理論依據。

4 結論

成功構建豬鏈球菌4型強毒株SH1510轉錄調控因子GalR基因缺失株SH1510Δ并對其部分生物學特性進行研究，結果表明，GalR基因缺失后，SH1510的細菌形態無顯著變化；在葡萄糖和蔗糖為糖原條件下，不影響細菌的生長，在D-半乳糖為糖原的條件下，導致細菌生長速率和OD600值降低；小鼠致病性降低1.62倍；體內定植能力極顯著降低（＜0.01）和全血存活能力顯著降低（＜0.05）。

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Biological Characteristics of Transcriptional Regulator GalR inSerotype 4

SUN Ke1,2, ZHU HaoDan1, HE KongWang1, WANG DanDan1, ZHOU JunMing1, YU ZhengYu1, Lü LiXin1, NI YanXiu1

(1Institute of Veterinary Medicine, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014;2College of Animal Science and Technology, Jilin Agricultural University, Changchun 130118）

【】The study was carried out to investigate the effect of the deletion of the transcriptional regulatorgene oftype 4 virulent strain SH1510 on the biological characteristics of bacteria in order to further study GalR regulation of galactose metabolism pathway and its pathogenesis, so as to provide a theoretical basis.【】The SH1510Δ, an SS4 virulent strain SH1510 transcriptional regulatorgene deletion strain, was constructed by homologous recombination double-crossover. Then, a preliminary screening of the deletion strain was performed by the internal amplification primers I1/I2 ofgene, and further identified the deletion strain SH1510Δby PCR and Western blotting. We performed Gram staining on the parental strain SH1510 and the deletion strain SH1510Δto compare morphological differences. We configured the basal medium, added glucose, sucrose and D-galactose to culture the bacteria, and plotted the bacterial growth curve to compare the bacteria’s utilization of different sugars. The bacterial concentration of the parent strain and the deletion strain were adjusted to 2.5×109CFU/mL, 5×108CFU/mL, 1×108CFU/mL and 2×107CFU/mL, respectively, and BALB/c mice were intraperitoneally injected. Then, the lethality of the mice was observed, and the strain LD50was calculated by using the Reed-Muench method. The parental strain and the deletion strain with a concentration of 2×107CFU/mL were mixed in an equal volume of 1﹕1 and intraperitoneally injected into BALB/c mice. After 24 h, brain, spleen and blood were counted on chloramphenicol-resistant and non-resistant THB plates to compare the colonization ability of bacteria in mice. The internal environment with the whole blood of healthy pigs was simulated, and then the parent strain and the deletion strain were separately and added to whole blood of healthy pigs containing SS4 antiserum, and incubated at 37℃ for 2 h for plate counting to compare the viability of bacteria in whole blood.【】PCR was performed by using the internal detection primer I1/I2, and the result showed that the deletion strain SH1510Δwas negative. Further, primers C1/C2, O1/C2, O2/C1, and O1/O2 were used to identify the deletion strain SH1510Δ, and 1 056, 2 121, 2 094, and 3 147 bp fragments were amplified, respectively, and the results were in agreement with expectations. The results of Western blotting showed that the parental strain SH1510 could specifically bind to the crude rabbit anti-GalR polyclonal serum, and a single band appeared at 37 kD, but the deletion strain SH1510Δshowed no band. The results of PCR and Western blotting indicated that the deletion strain SH1510Δwas successfully constructed. The parent strain and the deletion strain were stained by Gram. The optical microscopic observation showed that the parent strain and the deletion strain were arranged in a chain, the length was similar, and the morphology was not significantly different. Under the growth conditions of glucose and sucrose as the sole glycogen, the growth of the parent strain and the deletion strain was similar; when the glycogen was D-galactose, the growth rate and OD600value of the deletion strain were significantly lower than that of the parent strain. In addition, it could be seen from the highest OD600value that the utilization rate of sugar bySH1510 was glucose＞sucrose＞D-galactose. In the mouse pathogenicity test, the LD50of the parent strain and the deletion strain were 1×108CFU and 1.62×108CFU, respectively, and the pathogenicity of the deletion strain to the mouse was decreased by 1.62 times.competitive infection test results showed that the number of bacteria isolated from deleted strains in the brain, spleen and blood of the mice was much lower than that of the parent strains, and the difference was extremely significant (＜0.01). The whole blood survival test showed that the survival rate of the parent strain was 35.2%, the survival rate of the deletion strain was 27.3%, and the survival rate of the deletion strain SH1510Δin the whole blood was significantly lower than that of the parent strain SH1510 (＜0.05).【】In summary, thegene could promote the utilization of galactose byserotype 4, and had direct or indirect regulation of the virulence of SH1510.

serotype 4; GalR; biological characteristics; virulence

10.3864/j.issn.0578-1752.2019.19.017

2019-01-22；

2019-04-17

國家公益性行業（農業）科研專項經費（201303041）、江蘇現代農業生豬產業技術體系（JATS（2018）259）

孫珂，Tel：15729396877；E-mail：sunke2012@126.com。

倪艷秀，E-mail：er1998@126.com

（責任編輯 林鑒非）