‘南通小方柿’赤霉素不敏感基因DkGAI2的克隆與功能分析

蔣夢婷，朱寧，龔洪泳，侯應軍，余心怡，渠慎春

‘南通小方柿’赤霉素不敏感基因的克隆與功能分析

蔣夢婷，朱寧，龔洪泳，侯應軍，余心怡，渠慎春

（南京農業大學園藝學院，南京 210095）

【】對的亞細胞定位及表達特性進行分析，并將轉化煙草，分析轉基因煙草的生理和形態指標，為的深入研究提供理論基礎。以‘南通小方柿’高通量轉錄組測序結果中標注的為原始序列（未發表），利用RT-PCR，3′RACE和5′ RACE技術從‘南通小方柿’中克隆得到的序列全長。利用生物信息學分析其序列特征，采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）分析在‘大方柿’及‘南通小方柿’5個不同物候期的表達特性以及在‘南通小方柿’不同組織中的表達特性，構建瞬時表達載體pCAMBIA-GFP-1302-，并瞬時侵染煙草分析的亞細胞定位，通過構建植物雙元表達載體，利用農桿菌介導法轉化煙草，經過GUS染色、RT-PCR對轉基因煙草株系進行鑒定；并將野生型和轉基因煙草移栽，于第一朵花開放時測定轉基因植株的株高、節間長度、葉片長寬比以及GA1和GA4含量。從‘南通小方柿’中克隆得到了1 827 bp的，DkGAI2核苷酸序列與獼猴桃（KF588651.1）、光皮燁（MF149049.1）、砂梨（KX078214.1）、蘋果（FJ535245.1）、葡萄（MG738718.1）的相似度達72%-80%，具有DELLA蛋白家族特有的DELLA結構域，屬于DELLA蛋白基因家族。編碼608個氨基酸，相對分子質量為66.5 kD，理論等電點為5.54，不穩定系數為50.41，無明顯疏水區，無跨膜區，無信號肽。序列系統進化分析結果顯示，與葡萄親緣關系最近。qRT-PCR結果顯示，在‘南通小方柿’5個不同物候期的表達量都高于‘大方柿’；在‘南通小方柿’不同組織中表現出組織表達特異性，其中，在老葉中表達量最高，其次為莖尖和幼葉，而在幼果中幾乎不表達。pCAMBIA-GFP-1302-融合蛋白的綠色熒光信號位于細胞核中，表明編碼蛋白位于細胞核。經過GUS染色和RT-PCR檢測，共獲得5個轉煙草株系，轉基因煙草葉片GA1含量增加，GA4含量降低，GA1和GA4總含量降低，且轉基因煙草植株出現植株矮化、節間縮短、葉片長寬比降低及花期延遲的表型。具有組織表達特異性，定位于細胞核，在‘南通小方柿’5個不同物候期的表達量均高于‘大方柿’。推測可能通過降低GA4的含量進而引起植株矮化。

南通小方柿；；基因克隆；亞細胞定位；組織特異性表達

0 引言

【研究意義】‘南通小方柿’（Linn. cv. Nantongxiaofangshi）作為珍稀矮生型柿品種之一，矮化性狀明顯，干性弱、樹姿開張且沒有明顯主干，被認為是一種優良的適于矮化密植栽培的柿品種[1]。DELLA蛋白作為植物特有的轉錄因子，在GA信號轉導途徑中發揮著重要作用，GA主要通過降解此蛋白來調節植物的生長發育[2]。開展‘南通小方柿’赤霉素不敏感基因的克隆與功能分析，對深入研究功能具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】擬南芥中有5種DELLA蛋白，包括GAI、RGA、RGL1、RGL2和RGL3[3]。Peng等[4]首次在擬南芥中克隆出GA不敏感型基因，并指出具有阻遏生長的作用，而突變體對GA信號不敏感，植株表現出不正常的矮化。研究表明，DELLA蛋白參與了水稻、大麥、小麥、番茄、草莓及油菜的形態建成，包括莖的伸長，幼苗彎鉤結構的形成，單個小葉的形成及匍匐莖的形成[5-9]。如油菜中的DS-3可編碼一種DELLA蛋白，負向調控油菜莖的伸長[10]。DELLA蛋白的功能還包括：抑制或延遲植物的開花[11]、減緩植物的避陰反應[12]、促進豆科植物與固氮根瘤菌的共生[13]、促進番茄保衛細胞氣孔關閉[14]、減緩由年齡引起的葉片衰老[15]、參與抵抗鹽脅迫等逆境等重要生命過程[16]、參與抵抗水稻病原體的免疫反應[17]。依據DELLA蛋白N端的保守結構域，現已從其他物種中分離出了多個DELLA蛋白基因，如擬南芥中的和[4,18]、小麥及玉米中的（）和（）[19]、水稻中的[20]、大麥中的[21]、紫花苜蓿中的[22]、莧菜中的[23]、蘋果中的[24]、大巖桐中的[25]等?！颈狙芯壳腥朦c】近年來，柿屬植物中與赤霉素信號轉導途徑相關基因的研究較少見，尤其是‘南通小方柿’赤霉素不敏感基因的研究更是少見。【擬解決的關鍵問題】從‘南通小方柿’中克隆得到全長序列，分析對煙草生長發育的影響，為今后的功能研究提供理論基礎。

1 材料與方法

試驗于2017年5月至2019年4月在南京農業大學果樹生物技術實驗室進行。

1.1 材料

1.1.1 植物材料 ‘南通小方柿’和‘大方柿’，以君遷子為砧木的3年生嫁接苗。轉基因所使用的煙草K326種子和供瞬時侵染用的本氏煙草（）種子均由南京農業大學果樹生物技術實驗室提供。

1.1.2 各種酶及生化試劑 各種限制性內切酶、rTaq DNA聚合酶、Prime STAR GXL DNA聚合酶、反轉錄試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒和質粒提取試劑盒均購自TaKaRa公司。T4DNA連接酶購自New England Biolabs公司。植物RNA提取試劑盒購自成都福際生物技術有限公司、植物DNA提取試劑盒購自南京天根生物技術有限公司。SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit購于Clontech公司（大連，中國）。

1.1.3 菌株及載體 pMD19-T Vector載體購于大連寶生物科技有限公司，pEASY-Blunt載體購自TransGenBiotech，大腸桿菌菌株DH-5α、農桿菌感受態EHA105均購自上海唯地生物技術有限公司，pCAMBIA1302-GFP、PBI121載體均由南京農業大學果樹生物技術實驗室提供。

1.2 方法

1.2.1中間片段的克隆 以‘南通小方柿’葉片轉錄組測序結果中標注的序列為原始序列（未發表），利用NCBI Primer-BLAST在線設計特異引物F和R，產物長度為1 521 bp。引物序列見表1，試驗所用引物均由上海捷瑞生物技術有限公司合成。

表1 ‘南通小方柿’DkGAI2克隆、表達及功能分析所用引物

以新鮮采取的‘南通小方柿’幼嫩葉片為材料，并按照植物總RNA提取試劑盒說明書上的步驟提取葉片總RNA，濃度儀檢測RNA的純度和濃度，并利用反轉錄試劑盒反轉錄為cDNA第一鏈。

（1）PCR反應體系為：5×GXL Buffer 5 μL，dNTP 2.0 μL，-F 0.5 μL，-R 0.5 μL，模板（cDNA） 1 μL，PrimeSTAR GXL 0.5 μL，用超純水補足至25 μL。

（2）PCR反應程序為：98℃ 3 min；98℃ 10 s，60℃ 15 s，68℃ 1 min 40 s，35個循環；68℃延伸10 min，4℃保存。

PCR產物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，紫外下拍照，切膠并利用膠回收試劑盒進行PCR產物的回收。將回收產物與平末端克隆載體pEASY-Blunt 連接并轉化大腸桿菌DH-5α。步驟如下：

①連接：吸取PCR產物4.5 μL，pEASY-Blunt 克隆載體0.5 μL，25℃反應15—20 min。

②轉化：取-70℃保存的大腸桿菌DH-5α，冰上融化，至半融化狀態時加入連接產物，用槍頭輕輕吹打混勻，冰浴30 min，42℃熱激90 s，于冰上放置2 min，立即加入700 μL無抗性的液體LB，混勻后于250 r/min、37℃搖床培養1 h。

③涂板：6 000 r/min轉速離心1 min，棄去上清液，吸取100 μL左右菌液均勻涂于含50 mg·L-1Km抗性的LB固體培養基上，37℃倒置培養8—12 h。

④陽性克隆檢測：挑取白色單菌落，接種在含有50 mg·L-1Km的LB液體培養基中，250 r/min、37℃搖菌培養6—8 h，菌落PCR檢測陽性克隆。

⑤測序驗證：取PCR檢測為陽性的菌液，送南京擎科生物技術公司測序。

1.2.23′端的獲得 cDNA的獲得同1.2.1，其中反轉錄時將Ramdom Primer替換為接頭引物3′ RACE Adapter（GCGAGCACAGAATTAATACGAC TCACTATAGGT12VN），此外，將反轉錄反應的溫度從37℃調至 42℃，反轉錄酶的失活溫度從85℃調至95℃。以通用外側引物與特異外側引物3′ GSP-1進行PCR擴增，擴增體系如下：cDNA 1 μL，5×GXL buffer 5 μL，dNTP 2 μL，上、下游引物各0.5 μL，PrimeSTAR GXL酶0.5 μL，超純水補足至25 μL。PCR 程序為：98℃ 4 min；98℃ 10 s，60℃ 15 s，68℃ 60 s，35個循環；68℃延伸10 min。將第一輪PCR產物稀釋10倍后做模板，以通用內側引物與特異內側引物3′ GSP-2進行第二輪擴增，PCR擴增體系和程序同上。產物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測并回收。將回收產物與pEASY-Blunt克隆載體相連接，轉化后取陽性克隆測序驗證。連接轉化步驟同1.2.1。

1.2.35′端的獲得 cDNA的獲得參照SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit（Clontech，Cat. Nos.634923 & 634924）。利用通用外側引物UPM和特異外側引物5′ GSP-1進行第一輪擴增，反應體系及程序如下：5×GXL buffer 5 μL，dNTP 2 μL，cDNA 1.0 μL，5′ GSP-1 0.5 μL，UPM 1 μL，PrimeSTAR GXL酶0.5 μL，ddH2O補足，終體積25 μL。反應條件為：98℃ 3 min；98℃ 10 s，60℃ 15 s，68℃ 60 s，35個循環；68℃ 7 min。將第一輪PCR產物稀釋10倍后做模板，以內側引物5′ GSP-2與NUP進行第二輪擴增，PCR擴增體系和程序同上。PCR產物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測并回收，將回收產物與pEASY-Blunt克隆載體相連接，轉化后取陽性克隆測序驗證。連接轉化步驟同1.2.1。

1.2.4序列分析 利用DNAMAN軟件及NCBI將測序驗證正確的3部分片段進行拼接，查找的ORF（最大開放閱讀框），并通過NCBI數據庫中的BLAST對其核苷酸序列和推導氨基酸序列進行序列相似性分析；利用protparam（http://web. expasy.org/protparam/）對氨基酸序列的蛋白質分子量和等電點進行分析；利用SignalP（http://www.cbs.dtu. dk/services/SignalP/）在線分析蛋白質的信號肽；利用ProtScale（https://web.expasy.org/cgi-bin/protscale/ protscale.pl）軟件預測蛋白質的疏水性；利用TMHMM Server V.2.0在線程序預測蛋白質的跨膜結構域；利用DNAMAN對編碼氨基酸序列進行同源性比對，利用MEGA 5.0軟件構建系統發育樹。

1.2.5的亞細胞定位

1.2.5.1瞬時表達載體的構建 在序列的兩端引入I和I酶切位點，提取正確克隆的質粒。與pCAMBIA-GFP-1302質粒同時用I和I進行雙酶切，酶切體系（20 μL）為載體質粒10 μL、I 1 μL、I 1 μL、BSA緩沖液2 μL、10×K Buffer 2 μL、ddH2O 4 μL。分別回收載體片段和目的基因片段，用T4DNA連接酶連接，將連接產物轉化DH-5α，PCR檢測陽性克隆，送公司測序，提取正確克隆的質粒。從而得到pCAMBIA-GFP-1302-瞬時表達載體。

1.2.5.2 瞬時侵染本氏煙草葉片 轉化農桿菌：取保存于-70℃的農桿菌感受態EHA105，掌心融化，處于半融化狀態后置于冰上，待其完全融化后，吸取1 μL pCAMBIA-GFP-1302/質粒于EHA105感受態中，冰浴5 min、液氮5 min、37℃水浴5 min、冰浴5 min，立即于超凈工作臺中加入700 μL不含激素的LB液體培養基，28℃、200 r/min培養2—3 h，6 000 r/min離心1 min收集菌液，棄上清，吸取100 μL左右的菌液均勻涂布于含50 mg?L-1Km和25 mg?L-1Rif的LB固體平板上，28℃倒置培養48—72 h。重懸浮液的配制：10 mmol?L-1MgCl2和10 mmol?L-1乙磺酸（EMS），兩種藥品單獨溶解后混合，高壓滅菌處理后，于超凈工作臺中冷涼后加入100 μmol?L-1的AS（乙酰丁香酮），密封好待用。菌液活化：吸取1 mL小搖陽性菌液（含EHA105重組質粒）于50 mL含50 mg?L-1Km的LB液體培養基中，28℃、200 r/min培養至OD600值約為0.5時，5 000 r/min轉速離心10 min，于超凈工作臺棄去上清液，加入不含激素的LB液體沖洗菌塊，盡量洗去菌體上的激素，5 000 r/min離心10 min后收集菌塊，并加入同等體積的重懸浮液，密封后于28℃、200 r/min培養2 h，室溫靜置2 h后侵染本氏煙草。注射：選取培養2—4周齡的本氏煙草植株，每株選2—3片葉，注射前澆足水分，于兩葉脈之間注射。葉片下表片事先用針尖頭輕戳一孔，將注射器口對準所戳小孔，并將注射過的葉片做好標記，注射后，葉片會出現濕潤的現象，注射完畢后立即放入培養箱中黑暗培養16 h，后正常光照，約3 d后，于激光共聚焦顯微鏡下觀察表達情況。

1.2.6 實時熒光定量PCR 分別于展葉期（2018年4月20日）、枯頂期（2018年5月16日）、開花期（2018年5月27日）、生理落果期（2018年6月11日）和果實著色期（2018年9月13日）對‘大方柿’和‘南通小方柿’的葉片進行取樣，并于2018年3—10月選取‘南通小方柿’不同部位的組織：由頂而下第3、4片幼葉，幼嫩的莖尖，由下往上第3、4片老葉以及幼嫩的果實，對‘南通小方柿’和‘大方柿’中5個不同物候期的表達特性及在‘南通小方柿’不同組織中的表達特性進行檢測，以柿為內參基因，利用Beacon Designer設計特異引物-YG-F和- YG-R（表1）。qRT-PCR 反應體系為：稀釋cDNA 1 μL，上、下游引物各 0.2 μL，SYBR Premix Ex Taq（TaKaRa）10 μL，ddH2O 8.6 μL。反應條件為95℃ 4 min；95℃ 25 s，60℃ 20 s，72℃ 43 s，40個循環。每處理重復3次，根據2?ΔΔCt公式計算結果，通過SPSS軟件計算標準誤差和差異顯著性。

1.2.7 表達載體PBI121-的構建 含酶切位點ORF片段的擴增：根據PBI121載體的酶切位點和中不含有的酶切位點，在開放閱讀框特異引物上、下游的5′端分別引入I（TCTAGA）和I（CCCGGG）酶切位點序列。引物序列如下：

F：5′-GC/TCTAGA/ATGAAGCGCGACC GCCGCA-3′；

R：5′-TCC/CCCGGG/TCACCTCTGGTG GGTCTGGA-3′。

以cDNA為模板，進行PCR擴增，反應體系為：cDNA 1 μL，5×GXL buffer 5 μL，dNTP 2 μL，上下游引物各 0.5 μL，PrimeSTAR GXL酶0.5 μL，超純水補足至25 μL。PCR程序為：98℃ 4 min；98℃ 10 s，60℃ 15 s，72℃ 60 s，35個循環；68℃延伸10 min。PCR產物用1.5%的瓊脂糖凝膠進行紫外拍照檢測，并切膠回收PCR產物，將回收產物與pEASY-Blunt克隆載體相連接，轉化大腸桿菌DH-5α，用帶酶切位點的引物進行菌落PCR檢測陽性克隆，將陽性克隆測序驗證。連接轉化步驟同1.2.1。

PBI121-表達載體的構建：將PBI121載體質粒和經測序驗證正確的克隆載體質粒同時用I和I進行雙酶切。酶切體系（20 μL）為載體質粒10 μL、I 1 μL、I 1 μL、BSA緩沖液2 μL、10×T Buffer 2 μL、ddH2O 4 μL。所有試劑均在冰上進行操作，并于37℃酶切反應2—3 h，將酶切產物點樣于1.5%的瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測，分別回收載體片段和目的基因片段，將回收后的大小片段與T4DNA連接酶于16℃連接12 h，并將連接產物轉化大腸桿菌DH-5α，連接轉化步驟同1.2.1。利用基因特異引物進行菌落PCR驗證陽性克隆，送生物公司測序。將測序正確的PBI121-重組質粒利用凍融法轉化農桿菌感受態EHA105。

1.2.8 農桿菌介導法遺傳轉化煙草及轉基因煙草的鑒定 用培養至OD600值約為0.5的陽性農桿菌單菌落菌液侵染切下的K326煙草葉片，侵染時間5 min，接種于共培養基中，暗培養3 d，用無菌水洗滌3次，無菌濾紙吸干水分，接種于含50 mg·L-1Km（卡那霉素，Kanamycin）的篩選培養基中，兩周換一次培養基，直至長出抗性芽。轉基因煙草的鑒定如下：（1）GUS染色：在超凈工作臺上剪取轉基因煙草及野生型煙草的葉片于1.5 mL離心管中，加入200 μL GUS染液以浸沒檢測葉片，37℃下染色6—12 h，用50%乙醇脫色30 min后用75%乙醇脫盡綠色，拍照獲取檢測結果。（2）RT-PCR檢測：對于GUS染色呈藍色的株系，進一步提取其葉片的RNA，利用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的質量，并于超微量濃度儀下檢測RNA的濃度，利用反轉錄試劑盒將提取的RNA反轉錄為cDNA，煙草內參基因檢測模板質量，以基因特異引物進行RT-PCR檢測。PCR程序：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸2 min，共30個循環；最后一輪72℃延伸10 min。PCR反應體系：DNA 1 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，dNTP 2 μL，上、下游引物各0.5 μL，rTaq酶0.15 μL，超純水補足至25 μL。反應結束，PCR產物用1%瓊脂糖凝膠檢測。

1.2.9 轉基因煙草GA1和GA4含量的測定 取野生型和轉基因煙草由頂而下的第4、5片完全展開葉0.5 g。采用ESI-HPLC-MS/MS方法測定GA1、GA4的含量。

1.2.10 轉基因煙草葉綠素含量的測定 選取移栽于室外4周的轉基因與野生型煙草的中部第4、5片葉，提取葉綠素。參照李合生[26]的方法提取，并使用分光光度計進行檢測。

1.2.11 轉基因煙草形態指標的測定 轉基因煙草和野生型煙草經過煉苗后，同時移栽定植于溫室，于第一朵花開放時進行株高、節間長度等形態指標的測定，每個株系選取3個重復單株進行測量。

1.2.12 數據統計與分析 利用SPSS 17.0軟件進行顯著性分析。利用Excel 2010軟件進行數據分析并作圖。

2 結果

2.1 基因克隆與序列分析

從‘南通小方柿’中克隆得到了827 bp的。生物信息學分析表明，核苷酸序列與獼猴桃（KF588651.1）、光皮燁（MF149049.1）、砂梨（KX078214.1）、蘋果（FJ535245.1）、葡萄（MG738718.1）的一致性達72%—80%。編碼608個氨基酸，相對分子質量為66.5 kD，理論等電點5.54，蛋白質不穩定系數為50.41。編碼的蛋白質無明顯疏水區，無跨膜區，無信號肽序列。具有DELLA蛋白家族特有的DELLA結構域，屬于DELLA蛋白基因家族。此外，編碼的氨基酸與葡萄（AEK06229.1）、光皮燁（AVP41333.1）、湖北海棠（ABL61270.1）、蘋果（ADH53778.1）、砂梨（AMZ00185.1）具有較高的相似性，序列一致性達65%—71%（圖1）。系統進化樹結果表明，與葡萄、毛白楊、獼猴桃、蘋果的親緣關系較近（圖2）。

2.2 DkGAI2的物候期表達特性

從圖3中可以看出在‘大方柿’和‘南通小方柿’5個不同物候期中存在表達差異。在‘南通小方柿’5個物候期的表達量均高于大方柿，且隨著物候期的推進，兩品種呈同樣的下降趨勢（圖3）。

2.3 DkGAI2的組織表達特異性

利用qRT-PCR方法檢測在‘南通小方柿’不同組織中的表達。結果表明，在老葉中的表達量遠遠高于在其他組織中的表達量，其次是幼葉和莖尖，而在幼果中幾乎不表達（圖4）。

2.4 DkGAI2基因的亞細胞定位

結果發現（圖5），pCAMBIA-GFP-1302-綠色熒光蛋白信號分布在細胞核中，而pCAMBIA- GFP-1302綠色熒光蛋白信號分布在細胞膜上，說明編碼蛋白定位于細胞核，在細胞核中發揮功能，具有轉錄因子的特征，是一類轉錄因子，且在植物生長發育過程中發揮著重要的整合作用。

2.5 轉基因煙草的鑒定

經過30 d的篩選培養，共獲得33個煙草抗性苗，GUS檢測結果表明，轉煙草株系中有6個GUS染色呈藍色，而野生型株系未染上藍色（圖6-A）。RT-PCR檢測結果顯示，陰性對照中沒有檢測到擴增條帶，在6株GUS染色為陽性的轉煙草株系中，有5個株系擴增出與陽性對照大小一致的特異條帶，膠回收、克隆測序表明，所擴增條帶為目的基因序列。初步證明已成功在煙草轉錄水平上表達（圖6-B）。

2.6 轉基因煙草的生理指標測定

轉基因煙草株系（L-2、L-3、L-11）葉片中GA1含量高于野生型，其中，野生型的GA1含量為1.22 ng?g-1，L-2、L-3和L-11株系GA1的含量分別為野生型的1.43、1.23和1.35倍。而轉基因株系中GA4含量均低于野生型，其中，野生型GA4含量為4.66 ng?g-1，而轉基因株系L-2、L-3、L-11的GA4含量分別為野生型的34.3%、24.7%和25.8%。結果表明，轉基因株系中GA1和GA4總含量均低于野生型，其中，野生型煙草GA1和GA4總含量為5.88 ng?g-1，而轉基因株系L-2、L-3和L-11的GA1和GA4總含量分別為野生型的57%、45%、48%（表2）。

通過對轉基因煙草葉綠素含量的測定，結果發現轉基因煙草葉片的葉綠素含量均高于野生型，植株葉片顏色更深綠。其中，野生型煙草葉片的葉綠素含量為0.78 mg?g-1，轉基因株系L-2、L-3、L-11的葉綠素含量分別為野生型的1.51、1.43和1.67倍。

圖1 DkGAI2編碼氨基酸同源性比對

圖2 DkGAI2系統進化樹

A：展葉期Leaf expanding period；B：枯頂期 Tip buds dying period；C：開花期 Flowering period；D：生理落果期 Physiological fruit-falling period；E：果實著色期 Fruit coloring period

不同小寫字母表示差異顯著（P＜0.05）。下同 Different lowercase letters indicate significant differences (P＜0.05). The same as below

A：pCAMBIA-GFP-1302-DkGAI2融合蛋白pCAMBIA-GFP-1302-DkGAI2 fusion protein；B：pCAMBIA-GFP-1302載體pCAMBIA-GFP-1302 vector

M：2000 DL Marker；1—6（A、B）：轉DkGAI2煙草株系 Transgenic tobacco plants；WT（A）、7（B）：野生型煙草 Wild-type tobacco；8（B）：PBI121-35S-DkGAI2重組質粒 PBI121-35S-DkGAI2 vector

2.7 轉基因煙草的形態指標測定

轉基因煙草植株表現出花期延遲、植株矮化、節間縮短等表型特征（圖7）。其中，野生型的株高為31.5 cm，轉基因株系L-2、L-3、L-11的株高分別為7.7、10.2和9.1 cm，分別為野生型的24.4%、32.4%和28.8%。此外，野生型的節間長度為17.5 cm，轉基因株系L-2、L-3、L-11的節間長度分別為野生型的25.7%、41.1%和37.1%。且轉基因株系葉片長寬比均顯著低于野生型，其中以L-11株系的葉片長寬比1.4為最小，而野生型的葉片長寬比為2.6（表2）。

3 討論

本研究中能使煙草表現出矮化表型， 這與前人擬南芥轉化煙草的研究結果一致[27]，且轉煙草植株表現出葉色深綠的表型，與前人關于擬南芥突變體的表型研究相同[4]，且在‘南通小方柿’和‘大方柿’5個不同物候期的表達呈現明顯差異，在‘南通小方柿’不同物候期的表達量均高于‘大方柿’，說明很有可能參與‘南通小方柿’矮化性狀的形成過程。矮化是作物育種中最有價值的性狀之一，矮化品種抗倒伏，易管理，并與增產穩產相關。高等植物體內與赤霉素（GA）相關的矮化有兩類：一類與其合成代謝有關，稱之為合成型矮生突變體。此突變體主要是由于GA合成酶異常而引起植株體內GA缺乏，從而導致植物出現矮化[28]。另一類與GA的信號轉導相關，被稱為GA響應型突變體。根據其表型特征又可分為細長型響應突變體和GA不響應矮化型突變體。前者表現出施用過量GA的莖和葉過度生長、葉色淺綠、開花提前等表型特征，如擬南芥[29]；后者與GA合成突變體的表型相似，這類突變體表現出矮化、葉色深綠、花期延遲等表型特征，且外源GA處理并不能使其恢復野生表型，如擬南芥（GA-insensitive-1）突變體、小麥(Reduced height 1-3) 、玉米和突變體[30]，研究表明小麥和以及玉米與擬南芥赤霉素不敏感基因（）屬于直系同源物[5]，本研究中，矮化的煙草株系的葉片長寬比與對照相比降低。

圖7 轉基因煙草形態指標的測定

表2 轉DkGAI2煙草生理及形態指標測定

‘南通小方柿’是目前在江蘇省南通市發現的唯一具有矮生性狀的柿品種，與‘大方柿’相比，其具有樹冠矮小、新梢生長量小、適應強等優良特點[1]。生物活性GAs是一組二萜酸，可在植物的整個生命周期中調節不同的發育過程。DELLA蛋白作為GA信號轉導通路中響應生長的關鍵阻遏物，屬于GRAS（GAI、RGA、SCARECROW）家族的蛋白亞家族，含有保守的C末端GRAS結構域，而GRAS蛋白家族中GAI和RGA因其N末端均具有DELLA和VHYNP兩個高度保守的酸性結構域，又被歸類于DELLA蛋白[31]。在擬南芥中，RGA（由repressor of ga1-3編碼）和GAI（由GA insensitive編碼）是調控莖伸長的主要抑制因子[5]。GAI和RGA的DELLA結構域的突變使其對GA信號引起的降解產生抗性，并導致GA不敏感的矮化表型[19]。本研究中，含有高度保守的DELLA結構域，屬于DELLA蛋白家族。且編碼的氨基酸與葡萄、蘋果、砂梨、芝麻的同源性達67%—75%，具有較高的相似性，說明在不同物種間的保守性較高。

關于DELLA蛋白的時空表達模式，不同植物DELLA蛋白的表達部位有所不同，和主要分布在棉花的營養器官以及纖維起始期和延伸期的胚珠中，其參與了棉花纖維的形成[32]；主要分布在大豆的葉、胚組織和花等部位[33]；主要分布于梅的莖和種子中[34]；主要表達于葡萄莖尖和葉片等部位[35]；主要分布在黃瓜莖和雄花芽中[36]。在‘南 通小方柿’老葉中表達最高，其次為幼葉和莖尖，而在幼果中幾乎不表達，這與前人研究結果基本一致[33-36]。

DELLA蛋白是一類調控所有GA反應的保守的生長抑制因子[37]。近年來，隨著蛋白基因組學和功能基因組學的研究，亞細胞定位、蛋白與蛋白之間的互作等研究越來越受到關注，其中，基因編碼蛋白的亞細胞定位研究已成為功能基因組學的重要內容?；蛩幋a的蛋白質序列中包含了該蛋白的定位信息，并在細胞中的特定部位發揮作用[38]。研究表明，DELLA蛋白定位在細胞核，發揮著轉錄因子的功能。且具有轉錄因子的特征，定位于細胞核，本研究中定位于細胞核，與前人研究結果一致[39]，說明是一類定位在核內的負轉錄因子，在植物生長發育過程中發揮著重要作用。

GAI因其N末端具有DELLA和VHYNP兩個高度保守的酸性結構域，屬于DELLA蛋白家族成員中的一員。是一類生長抑制因子，負向調控莖的生長。GA是植物體內重要的內源激素之一，對植物生長發育具有重要意義，GA1、GA3、GA4和GA7為植物體內有生物活性的GA[40]。本研究中，過表達煙草株系的GA1和GA4總含量均低于對照，這可能是引起煙草植株出現矮化表型的主要原因。此外，轉基因煙草植株的GA1含量上升，GA4含量降低，說明主要是通過降低GA4的含量進而引起植株矮化。

4 結論

從‘南通小方柿’中克隆得到1 827 bp的，其含有高度保守的DELLA結構域，屬于DELLA蛋白家族。系統進化樹結果表明，DkGAI2與毛白楊、蘋果、梅親緣關系較近。亞細胞定位結果表明DkGAI2定位于細胞核。在老葉中表達量最高，其次為幼葉和莖尖，而在幼果中表達量最低。物候期表達分析結果表明在‘南通小方柿’5個不同物候期的表達量均高于‘大方柿’。過表達的煙草葉片GA1含量增加，GA4含量降低，GA1和GA4總含量降低，且轉基煙草表現出植株矮化、節間縮短、葉片長寬比降低及花期延遲等現象。

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Cloning and Function Analysis of Gibberellin InsensitiveGene in Nantongxiaofangshi (Linn. cv. nantongxiaofangshi)

JIANG MengTing, ZHU Ning, GONG HongYong, HOU YingJun, YU XinYi, QU ShenChun

（College of Horticulture, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095）

【】In this study, the full-length sequence of gibberellin insensitive gene () was obtained from the leaf of Nantongxiaofangshi (Linn. cv. nantongxiaofangshi), named as. The subcellular localization and expression characteristics ofgene were analyzed. Thengene was transformed into plant tobacco, and the morphological and physiological indicators of the transgenic tobacco plants were determined. Our study would provide a theoretical basis for the future research ofgene.【】The full-length sequence ofgene was cloned from Nantongxiaofangshi by RT-PCR, 3’ RACE and 5’ RACE using the labeledgene as the original sequence of high-throughput transcriptome sequencing of Nantongxiaofangshi (Unpublished). Sequence characteristics were analyzed by bioinformatics. The expression characteristics ofgene in five different phenological stages of Dafangshi and Nantongxiaofangshi, and the expression level ofgene in different tissues of Nantongxiaofangshi was detected by real-time quantitative PCR (qRT-PCR). The transient expression vector pCAMBIA-GFP-1302-was constructed and was transiently infected with tobacco to analyze the subcellular localization ofgene.gene driven by the 35S promoter was constructed and delivered into plant tobacco by Agrobacterium-mediated transformation approach. Transgenic plants were identified by using GUS staining and RT-PCR. After transplanting, the plant height, internode length, leaf aspect ratioand the content of GA1and GA4in transgenic tobacco plants were measured at the first flowering stage.【】1 827 bp ofwas cloned from Nantongxiaofangshi, the nucleotide sequence ofgene shared 72%-80% in homology compared with kiwifruit (KF588651.1), light skin (MF149049.1), pear (KX078214.1), apple (FJ535245.1) and grape (MG738718.1).gene containing DELLA and GRAS conserved special domain, belonging to DELLA protein gene family.gene encoding a putative protein about 608 amino acids, the relative molecular mass ofgene was 66.5 KD, the theoretical isoelectric point was 5.54, and the instability coefficient iwas 50.41, without obvious hydrophobic region, without transmembrane domain and signal peptide. Phylogenetic analysis showed that thegene had close relationship with grape. qRT-PCR result showed that the expression level ofgene in five different phenological stages of Nantongxiaofangshi was higher than that of Dafangshi.gene showed tissue expression specificity in different tissues of Nantongxiaofangshi, which had the highest expression in old leaves, followed by young leaves and shoot tips, while it had the lowest expression in fruitlet. The green fluorescent signal of the pCAMBIA-GFP- 1302-fusion protein was located in the nucleus, indicating thatgene localized in the nucleus. After GUS staining and RT-PCR detection, 5 transgenic tobacco lines ofgene were obtained. The GA1content of transgenic tobacco leaves were increased, the GA4content were decreased, the total content of GA1and GA4weredecreased, and the transgenic tobacco plants showed plant dwarfing phenotypes with shortened internodes, reduced leaf aspect ratio, and delayed flowering.【】genehad tissue expression specificity;gene localized in the nucleus, the expression level ofgene in Nantongxiaofangshi was higher than that of Dafangshi at the five different phenological periods. It was speculated thatmay cause plant dwarfing by reducing GA4content.

Nantongxiaofangshi;; gene cloning; subcellular localization; tissue specific expression

10.3864/j.issn.0578-1752.2019.19.012

2019-04-18；

2019-07-25

國家公益性行業（農業）科研專項經費項目（201203047）

蔣夢婷，E-mail：2016104025@njau.edu.cn。

渠慎春，E-mail：qscnj@njau.edu.cn

（責任編輯 趙伶俐）