白背飛虱海藻糖合成酶基因調控幾丁質合成的功能

張道偉，余亞婭，潘碧瑩，康奎，曾伯平，陳靜，唐斌,

白背飛虱海藻糖合成酶基因調控幾丁質合成的功能

張道偉1，余亞婭2，潘碧瑩3，康奎1，曾伯平1，陳靜2，唐斌1,3

（1遵義師范學院生物與農業科技學院/赤水河流域動物資源保護與應用研究重點實驗室，貴州遵義 563006；2遵義醫科大學基礎醫學院，貴州遵義 563006；3杭州師范大學生命與環境科學學院，杭州 310036）

海藻糖合成酶（trehalose-6-phosphate synthase，TPS）在海藻糖合成中起著重要作用，其能夠介導海藻糖代謝調控幾丁質合成及昆蟲發育。【】本研究通過抑制白背飛虱（）的表達，檢測RNAi沉默效果，觀察白背飛虱蛻皮狀況，測定幾丁質含量及幾丁質合成酶（chitin synthase，CHS）基因的定量表達，探究在白背飛虱幾丁質合成中的潛在調控作用。利用注射法RNAi技術，以實驗室飼養多年的白背飛虱種群為試驗材料，體外合成兩個（和）與的雙鏈RNA（dsRNA）后，分別注射到白背飛虱體內抑制。首先，在dsRNA注射后48 h采用Trizol法提取白背飛虱的總RNA，反轉錄并合成第一鏈DNA后，采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術檢測表達沉默情況，以確定RNAi的效果；其次，測定dsRNA注射后48 h和72 h白背飛虱整體幾丁質含量并對翅發育畸形蟲體進行拍照；最后，采用qRT-PCR技術檢測白背飛虱在mRNA水平上的相對表達量變化，分析和在幾丁質合成調控中的作用。與注射ds相比較，ds和ds的RNA注射后，能夠促進表達量上升，幾丁質含量增加，白背飛虱成蟲翅出現畸形。qRT-PCR結果顯示，單個dsRNA注射后本基因的表達能夠被極顯著抑制，與注射ds相比，不足對照組表達量的30%，且單個的dsRNA注射后，另外一個表達同樣顯著下降；ds和ds注射后，白背飛虱成蟲翅均為長翅，出現一定比例的翅卷曲等畸形情況，其后48 h和72 h產生一定的死亡率；幾丁質含量檢測發現，和的dsRNA注射后72 h，幾丁質含量顯著上升。與注射ds對照組相比較，與表達量在ds注射后72 h極顯著上升，在ds注射后48 h和72 h時極顯著上升，且ds和ds注射后的表達極顯著增加。能夠通過調控白背飛虱幾丁質合成酶基因的表達來控制幾丁質的合成，研究結果有助于評價在白背飛虱等昆蟲中的調控作用并作為潛在控害靶標，為進一步開展和篩選有效的海藻糖合成酶抑制劑控制白背飛虱等害蟲提供理論依據。

白背飛虱；海藻糖合成酶；RNAi；幾丁質合成；實時熒光定量PCR

0 引言

【研究意義】水稻（）是我國最重要的糧食作物之一，保障水稻的高產、穩產在我國糧食安全生產中占有極其重要的地位。然而，水稻害蟲種類較多[1]，其中稻飛虱已成為水稻的頭號害蟲[2]，其主要包括褐飛虱（）、白背飛虱（）和灰飛虱（）3種。飛虱為單食性害蟲，僅對水稻產生危害，其具有生命周期短、繁殖速度快、遷飛擴散能力和環境適應性強等特點[3-6]。目前，白背飛虱已成為我國以及亞洲部分國家水稻上的首要害蟲，也是水稻中前期重要的遷飛性害蟲之一，危害范圍廣，防治難度大[7]。探究白背飛虱海藻糖合成酶基因（）對幾丁質合成的影響，對篩選適合的害蟲控制靶標防治白背飛虱具有重要意義。【前人研究進展】海藻糖作為一種雙糖，不僅存在于植物、真菌和細菌中，在無脊椎動物中也分布較廣，特別是在昆蟲血淋巴中，海藻糖含量非常高，作為昆蟲的“血糖”，在昆蟲的生長發育、變態和繁殖等過程中均具有非常重要的功能[8-9]。海藻糖的合成途徑不止一種，在昆蟲中主要利用底物葡萄糖，通過海藻糖合成酶（trehalose-6-phosphate synthase，TPS）途徑在脂肪體中合成[10-11]，在能量需求時通過海藻糖酶（trehalase，TRE）降解為葡萄糖，從而進入能量代謝和幾丁質合成通路中[12-14]。眾所周知，幾丁質和相應的蛋白質是昆蟲外骨骼的主要組成部分，并且昆蟲表皮、氣管和圍食膜等結構的主要成分也是幾丁質，當幼蟲生長到特定的階段時都需要重塑幾丁質結構，完成蛻皮行為，這個過程主要由幾丁質合成通路和幾丁質酶及其復合體共同完成[15]。幾丁質合成通路中，總共包含8個不同的基因家族，海藻糖酶為昆蟲幾丁質合成通路的第一個酶，幾丁質合成酶（chitin synthase，CHS）為幾丁質合成的最后一個酶，也是最為重要的[13,15]。CHEN等研究表明，和的表達被抑制后，昆蟲的幾丁質合成均會受到嚴重的阻礙，導致其蛻皮困難，不能完成正常的生長發育而死亡[12,16-17]。【本研究切入點】在褐飛虱和德國小蠊（）中克隆和發現了2個不同的家族基因[18-19]，尤其在褐飛虱中存在著第3條[14,20-21]。采用RNAi技術抑制的表達，同樣能夠引起昆蟲的蛻皮困難，并導致昆蟲一定的死亡率[19,22]，這表明在幾丁質合成中起著一定的調控作用，但對其具體的調控作用以及不同之間是否存在差異的研究較少。在白背飛虱中同樣發現存在2條不同的[23]，該基因是否能夠調控幾丁質合成以及如何調控幾丁質合成尚未明確，因此選擇白背飛虱為研究對象探究的功能。【擬解決的關鍵問題】研究白背飛虱在其幾丁質合成通路中的調控功能，評估昆蟲海藻糖合成途徑與幾丁質合成途徑的關聯性，探索是否具備成為害蟲防治的靶標基因的潛力，為開發白背飛虱等水稻害蟲的生物農藥提供理論依據。

1 材料與方法

試驗于2018年在遵義師范學院和杭州師范大學完成。

1.1 供試蟲源

白背飛虱來自遵義師范學院生物與農業科技學院飼養種群，水稻品種全部采用感蟲水稻TN-1。白背飛虱基因功能試驗從4齡開始統一收集，待其長至5齡若蟲后，用于后期注射試驗。

1.2 試驗方法

1.2.1 總RNA的抽提及cDNA合成 白背飛虱的蟲體總RNA抽提采用Trizol法，嚴格依據試劑盒說明書進行。提取后用1.2%的瓊脂糖檢測總RNA的質量，并用NanoDropTM2000分光光度計測定其純度和濃度。cDNA合成依據PrimeScript?RT reagent Kit With gDNA Eraser試劑盒說明書進行。

1.2.2 dsRNA的合成 根據已知的白背飛虱核苷酸序列，選擇2個合適的dsRNA特異性片段進行引物設計與合成。具體引物序列見表1，dsRNA的合成方法參考T7 RiboMAXTMExpress RNAi System試劑盒的說明進行。合成的dsRNA采用NanoDropTM2000測定濃度。同時以為模板，采用同樣的方法合成的dsRNA，作為對照組[17]。最后，用于白背飛虱顯微注射的dsRNA片段長度分別為ds（523 bp）、ds（509 bp）以及作為對照的ds（738 bp），其中、dsRNA設計區域比較見圖1。

1.2.3 白背飛虱的顯微注射、觀察統計及材料選取 用于顯微注射的材料分為ds、ds以及作為對照的ds。取5齡第1天的白背飛虱用于顯微注射，顯微注射儀參數調節為注射壓強200 hPa，注射時間0.5 s，補償壓20 hPa，注射量為50 ng/頭。注射后將飛虱放入含水稻的玻璃管中，用棉塞塞住管口，將玻璃管放入人工氣候室，環境條件設置為溫度（26±0.5）℃；光周期L﹕D=16 h﹕8 h，相對濕度（50±5）%。24 h后白背飛虱的存活數為有效注射數。注射后分成4批飼養，每批≥3個重復。第1批每隔24 h觀察白背飛虱的發育情況，在48 h和72 h統計畸形數和死亡數；第2批注射后48 h和72 h分別取材，進行熒光定量（qRT-PCR）分析RNAi抑制效果及表達；第3批在注射后48 h 和72 h，用于測定幾丁質含量；最后一批待其蛻皮為成蟲后，觀察畸形情況并進行拍照。

1.2.4 RNAi后抑制效果及表達量測定 白背飛虱顯微注射后48 h和72 h取蟲體材料用于qRT-PCR檢測，引物見表2，試驗方法參照張露等[24]。

表1 dsRNA合成引物序列

T7 sequence: GGATCCTAATACGACTCACTATAGG

圖1 白背飛虱TPS1、TPS2核苷酸序列比對圖

表2 實時熒光定量PCR檢測引物序列

1.2.5 幾丁質含量的測定 白背飛虱幾丁質所占比例的檢測方法參考文獻[24-25]并做適當修改。主要步驟包括：（1）消化管：在一根長約30—50 cm的橡膠管兩頭接上兩個玻璃管，再取一根試管配帶孔橡膠塞，將橡膠管一端的玻璃管嵌入橡膠塞中，另一端則通入水中，預防堿液濺出；（2）樣品量：將白背飛虱分為每組40頭，平行3組，50℃烘箱內烘干至恒重；（3）將烘干的白背飛虱進行稱重，記為W1；（4）把烘干后蟲體倒入消化管中，加入5 mL飽和氫氧化鉀溶液，160℃甘油浴，加熱至蟲體變透明薄膜；（5）用濾紙制成漏斗狀過濾殘渣，小心用水沖洗干凈后置于50℃烘箱中烘干，稱重并計為W2；（6）按照公式計算幾丁質的相對含量。幾丁質的相對含量（%）=（W2/W1）×1.26×100，其中1.26為乙酰氨基葡萄糖與氨基葡萄糖的相對分子質量之比。

1.2.6 數據統計與分析 通過qRT-PCR測定基因的CT值，每個生物學重復均設3個技術重復，3個技術重復的數值進行兩兩比較，數值相差在0.5以內可用，3個數值中有2個或3個接近，數值可用，否則重做。每次樣品有3組生物學重復，即最后得到的數據為平均值±9個重復。再利用2-ΔΔCT法運算，以白背飛虱ds注射組的CT值為對照組。最后將換算出的值再進行具體分析。2-ΔΔCT計算公式[26]：

2-ΔΔCT=2-[(CT對照組-CT對照18s)- (CT待測組-CT待測組18s)]

應用Excel軟件整理數據，并使用SPSS軟件進行統計分析，One-Way ANOVA法進行差異顯著性檢驗（＜0.05為差異顯著，用*表示；＜0.01為差異極顯著，用**表示），數據表示為平均值±標準誤。處理后的數據采用SigmaPlot 10.0作圖。

2 結果

2.1 RNAi后SfTPS表達及蛻皮情況

采用dsRNA注射到白背飛虱體內后，發現RNAi能夠有效抑制表達。在ds和ds注射后48 h與72 h，和的表達分別極顯著低于注射ds后的表達，表達量不足對照組的30%；注射ds或ds后，非靶標的表達同樣極顯著降低（圖2-A、2-B）。ds和ds均能夠引起白背飛虱蛻皮為成蟲后翅畸形（圖2-C），但是表皮蛻皮障礙不明顯。

2.2 RNAi抑制SfTPS表達后幾丁質含量的變化

與對照組相比，ds注射后48 h和72 h幾丁質含量極顯著上升，而ds注射后72 h幾丁質的含量同樣極顯著上升（圖3）。結果表明，表達下降反而促進了白背飛虱蟲體中幾丁質含量提高。

圖2 RNAi后白背飛虱TPS的相對表達量及成蟲蛻皮情況

2.3 SfTPS RNAi后SfCHS及可變轉錄子表達變化

飛虱中不存在家族基因，但存在兩個不同的間接變異體[27]。采用RNAi抑制和表達后，在mRNA水平上檢測幾丁質合成酶及其兩個不同轉錄子和的表達。結果顯示與表達趨勢一致，與對照注射ds組相比，注射ds后72 h表達量極顯著上升，而在48 h時無顯著差異；注射ds后48 h和72 h時表達量均極顯著上升（圖4-A、4-B）。此外，注射ds和ds后能夠有效提高的表達，在和表達被抑制后的48 h和72 h的表達量均為極顯著升高（圖4-C）。

2.4 SfTPS RNAi后白背飛虱的畸形率和死亡率

為了解幾丁質合成提高對畸形率和死亡率的影響，測定了和表達被抑制后48 h和72 h的畸形率和死亡率。結果表明，盡管ds和ds注射后48 h和72 h白背飛虱死亡率相對較低，72 h內死亡率未超過10%，但與注射ds組相比，均存在顯著或極顯著差異（圖5-A）；ds組處理后，白背飛虱無畸形情況出現，但和表達被抑制后48 h畸形率顯著或極顯著上升，且在72 h均極顯著上升（圖5-B）。

圖3 RNAi后白背飛虱體內幾丁質的含量變化

圖4RNAi后及可變轉錄子的相對表達量

Fig. 4 The relative expression ofand variants transcripts afterRNAi

3 討論

海藻糖在脂肪體中合成后，會被釋放到血淋巴中，通過淋巴循環輸送到各個組織中發揮功能[22,28]。AVONCE等研究表明，海藻糖具有5種不同的潛在合成途徑，昆蟲主要通過海藻糖合成酶（TPS）/海藻糖-6-磷酸脂酶（TPP）途徑[29]，也很有可能能夠直接通過單一的來完成，TPS包含了TPS和TPP兩個保守結構域，且不少物種未發現單獨[14]。目前，在德國小蠊、褐飛虱和白背飛虱中發現2個或2個以上的[18-19]，而在荒漠甲蟲小胸鱉甲（）的高通量測序中發現了5個潛在的Unigenes[30]，這些結果表明昆蟲的海藻糖合成途徑一直在進化中，但是如何進化以及具體的進化方向卻研究較少。基于海藻糖的重要功能，的研究也受到越來越多的關注，其功能研究的主要方法就是通過RNAi技術，采用注射dsRNA或siRNA抑制其基因的表達[31]，探索其調控的潛在通路等。RNAi抑制通常具有沉默特定基因的功能，然而最新的研究發現當基因被敲低或敲除后，同家族基因會存在互補效應，即表達上升[32]，這種現象在褐飛虱中同樣存在[33]。然而，在褐飛虱體內單獨干擾和，結果表明無論干擾還是，與的轉錄量均減少[19]；本試驗中，當注射ds或ds后，另外一個的表達同樣受到抑制（圖2-A、2-B），原因可能與相對保守程度較高有關，需要進一步研究確定。

圖5 SfTPS RNAi后白背飛虱的畸形率和死亡率

當沉默昆蟲發育的關鍵基因后，通常會在不同的組織表型上顯示出來[34-36]。如甜菜夜蛾（）表達被抑制后48 h和204 h，其死亡率分別為50.94%和66.76%，顯著低于ds對照組[22]。同樣，褐飛虱和表達被抑制后，成蟲出現蛻皮障礙，翅不能完全形成，畸形率達到20%，而死亡率接近30%[19]；褐飛虱表達被抑制后，同樣出現類似的蛻皮畸形現象[21]；而在白背飛虱中，未發現蛻皮困難的畸形，僅發現翅能夠生長完整，但存在一定的畸形（圖2-C），72 h內死亡率也比畸形率要高（圖5）。綜合褐飛虱和白背飛虱的功能研究情況，表明部分飛虱在表達被抑制后，無明顯的畸形便死亡，其原因可能是腸道圍食膜或氣管的幾丁質合成受到影響[37]，更為可能的是由于能量代謝被調控而引起死亡[11]。

幾丁質合成的通路始于海藻糖酶，終于幾丁質合成酶（CHS），幾丁質合成和降解的動態平衡在昆蟲蛻皮中起著尤為重要的作用[13,15]。抑制褐飛虱、和表達后發現，對和的干擾會導致褐飛虱翅畸形、細腰、表皮皺縮甚至死亡[27]。而當表達被抑制時，昆蟲同樣會出現發育畸形、體重減輕、幾丁質合成減少、生長受阻、飛行減少甚至死亡的現象[10]，特別是采用海藻糖酶抑制劑處理褐飛虱后，其幾丁質含量顯著下降[38]。這些研究表明，和等表達抑制后，會降低幾丁質含量，而本試驗中發現白背飛虱和表達被抑制后，幾丁質含量基本是顯著上升的（圖3），飛虱成蟲翅發育為長翅，無縮小畸形等，也間接表明幾丁質含量較高（圖2-C）。而在赤擬谷盜（）中，表達抑制后，在72 h存在上升或顯著上升，在48 h和72 h均顯著下降，部分蟲體不能正常化蛹，并且幾丁質含量降低[39]。這是否說明和可能調控飛虱幾丁質通路的結果或效果不同？能夠抑制或提高幾丁質酶（chitiase，Cht）的表達[25,33]，打破合成的平衡，導致幾丁質含量降低。而表達抑制后，能夠促進的表達（圖4），增加幾丁質含量（圖3），并且在時間節點上，干擾白背飛虱和后幾丁質含量及、的變化趨勢一致，而在時間節點的變化趨勢有差異（圖3、圖4），這說明兩個對幾丁質代謝的影響機制不完全相同。同樣部分昆蟲中表達被抑制后也能夠使幾丁質的合成受到抑制[39]，導致幾丁質代謝平衡的紊亂。對褐飛虱和的功能研究發現，當和表達抑制后48 h，和表達降低或顯著降低，而和在72 h卻表達上升或顯著上升[33]。為什么在飛虱和赤擬谷盜中存在不一樣的情況，可能與飛虱的短翅和長翅型有一定的關聯，圖2-C中白背飛虱為長翅型，其幾丁質含量在上升，而褐飛虱短翅型中幾丁質合成明顯受到阻礙[19]。綜上所述，當抑制白背飛虱幾丁質合成通路中或其他酶基因的表達，會導致幾丁質含量降低從而導致蛻皮困難現象；而幾丁質含量的上升也能導致昆蟲翅發育畸形及死亡。

4 結論

海藻糖合成酶基因（）作為海藻糖合成的關鍵基因，其能夠介導幾丁質合成酶基因（）表達以調控幾丁質合成，即當白背飛虱海藻糖合成途徑中表達被抑制后，會通過促進的表達，提高幾丁質含量，影響昆蟲的生長及翅發育。

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Regulation function of trehalose-6-phosphate synthase genes on chitin synthesis in

ZHANG DaoWei1, YU YaYa2, PAN BiYing3, KANG Kui1, ZENG BoPing1, CHEN Jing2, TANG Bin1,3

(1College of Biology and Agriculture, Zunyi Normal University/Key Laboratory of Protection and Utilization of Animal Resource in Chishui River Basin, Zunyi 563006, Guizhou;2College of Basic Medical Science, Zunyi Medical University, Zunyi 563006, Guizhou;3College of Life and Environmental Science, Hangzhou Normal University, Hangzhou 310036)

【】It is well known that trehalose-6-phosphate synthase (TPS) plays an important role in trehalose synthesis, which can mediate trehalose metabolism to regulate chitin synthesis and insect development. 【】In this study, the effect of silencingwas detected, the molting status ofwas observed and the content of chitin and the quantitative expression of chitin synthase (CHS) gene were determined through inhibiting the expression ofby RNAi in. The purpose is to explore the potential regulatory effects ofon the chitin synthesis in.【】Thepopulation, which has been fed in laboratory for many years, was used as experimental material. The double-stranded RNA (dsRNA) ofandwere synthesizedin order to study the potential function of, the RNA of two ds(dsand ds) was injected into, respectively. Firstly, after dsRNA injection, the total RNA ofwas extracted by Trizol method at 48 h, and the first strand DNA was synthesized as the template of quantitative real-time PCR (qRT-PCR). As well as qRT-PCR was used to detect the silencing ofexpression for the effect of RNAi. Secondly, the whole chitin ofwas detected at 48 and 72 h after dsRNA injection, and photographs were taken of the winged developmental malformations. Finally, the relative expression level ofinwas detected by qRT-PCR, and the roles ofand2 in the regulation of chitin synthesis were analyzed.【】Compared with dsinjection, the expression ofincreased after dsand dsinjection, as well as the chitin content increased, which lead to the wing deformity of. The qRT-PCR results showed that the expression ofwas significantly inhibited after dsRNA injection of a single, which was less than 30% of that in the control group injected with ds. In addition, the expression of anotheralso decreased significantly after a singledsRNA injection. The adult wings ofwere all long wings after dsand ds2 injection. Some deformities such as wing curl in a certain ratio had been found in these long wings, and a certain ratio of mortality was found at 48 and 72 h. The chitin content increased significantly at 72 h after these two dsRNA injection. Compared with the control group, the expression ofandincreased significantly at 72 h after dsinjection, followed it increased significantly at 48 and 72 h after dsinjection. In the same time, the expression ofincreased significantly after dsand dsinjection.【】Thecan control the synthesis of chitin through the regulation of chitin synthase gene in. The results are helpful to evaluate the regulatory role ofinand other insects and as the potential pest control target. It provides a theoretical basis for further development and screening of effective trehalose-6-phosphate synthase inhibitors to controlpests and so on.

white-backed planthopper(); trehalose-6-phosphate synthase (TPS); RNA interference;chitin synthesis; quantitative real-time PCR (qRT-PCR)

10.3864/j.issn.0578-1752.2019.19.007

2019-05-05；

2019-06-10

國家自然科學基金（31560511，31672081）、貴州省科學技術基金（黔科合JZ字[2014]2014號）

張道偉，E-mail：zhangdw1000@163.com。

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（責任編輯 岳梅）