棉鈴蟲中腸特異性結合蛋白ABCC1對Cry1Ac毒力的影響

陳琳，魏紀珍，劉臣，牛琳琳，張彩虹，梁革梅

棉鈴蟲中腸特異性結合蛋白ABCC1對Cry1Ac毒力的影響

陳琳1，魏紀珍2，劉臣1，牛琳琳1，張彩虹1，梁革梅1

（1中國農業科學院植物保護研究所植物病蟲害生物學國家重點實驗室，北京 100193；2河南農業大學植物保護學院，鄭州 450002）

【】研究棉鈴蟲（）中腸蛋白ABCC1（HaABCC1）與Cry1Ac的結合特性及對Cry1Ac毒力的影響，明確HaABCC1在Cry1Ac殺蟲機制中的作用。分析基因序列，設計引物，通過原核表達得到HaABCC1兩個跨膜區片段的蛋白，與Cry1Ac進行Ligand blot試驗，驗證其與Cry1Ac的體外結合特性；利用RNAi技術干擾棉鈴蟲幼蟲的，在3齡幼蟲腹部注射siABCC1，比較的表達量及Cry1Ac處理后棉鈴蟲死亡率的變化；通過細胞轉染將ABCC1導入Sf9細胞系中，確定pAc-ABCC1重組質粒轉入Sf9細胞后，用細胞生物測定的方法比較Cry1Ac處理后細胞死亡率的變化；比較敏感品系（96S）和Cry1Ac抗性品系（BtR）棉鈴蟲的基因全長序列，并通過熒光定量RT-PCR檢測在抗、感棉鈴蟲中的表達量。HaABCC1跨膜區TMD1和TMD2在BL21（DE3）感受態細胞中成功表達，兩個HaABCC1跨膜區片段蛋白均能與活化的Cry1Ac在體外結合；棉鈴蟲注射siABCC1后，的表達量顯著下降，與未注射的棉鈴蟲、注射DEPC水和siEGFP的棉鈴蟲相比，用活化的Cry1Ac蛋白處理被干擾的棉鈴蟲，其幼蟲死亡率顯著降低，表明棉鈴蟲幼蟲的被干擾后，能顯著降低Cry1Ac對棉鈴蟲的毒力；用活化的Cry1Ac蛋白處理成功轉入的Sf9細胞，與對照Sf9細胞相比，細胞的死亡率明顯上升，表明將導入Sf9后能顯著提高Cry1Ac處理后的細胞死亡率；抗性品系（BtR）與敏感品系（96S）棉鈴蟲的氨基酸序列沒有差別，但抗性品系BtR棉鈴蟲的表達量顯著降低。HaABCC1是Cry1Ac的特異性結合蛋白，可能是Cry1Ac的功能受體蛋白，并可能參與對Cry1Ac的抗性機制。

棉鈴蟲；ABCC1；蘇云金芽孢桿菌；Cry1Ac；結合蛋白；毒力

0 引言

【研究意義】蘇云金芽孢桿菌（，Bt）產生的晶體蛋白對鱗翅目、雙翅目、鞘翅目等多種昆蟲和線蟲具有特異性毒性，但對人畜無害[1-4]。Bt能夠產生具有殺蟲活性的伴孢晶體，Cry蛋白是伴孢晶體中的重要一類，目前已發現約有300多種可以分為40個不同的小類Cry蛋白，Cry1Ac蛋白是其中最早被應用于害蟲防治的[1-4]。表達Bt蛋白的抗蟲轉基因農作物已在美國、巴西、印度、中國等多個國家廣泛種植，這不僅可以有效降低相關農業害蟲的危害，還可以減少由于化學農藥過度使用帶來的環境污染[4-5]。但是隨著轉Bt基因農作物種植面積的擴大，害蟲對Bt蛋白的抗性[3,6-8]問題也日益嚴重。因此，研究昆蟲對Bt蛋白產生抗性的機理對于延遲抗性產生至關重要?！厩叭搜芯窟M展】當昆蟲取食Bt蛋白后，Bt蛋白會在昆蟲中腸堿性環境中被溶解、活化，并與中腸上皮細胞上的特異性受體結合，隨后造成中腸膜穿孔，細胞溶解，最終導致昆蟲死亡[3]。Bt蛋白與昆蟲中腸受體結合是其發揮殺蟲作用的關鍵，主要受體蛋白表達量的變化或基因突變是引起昆蟲對Bt蛋白產生抗性的重要原因。目前報道的主要受體蛋白有鈣黏蛋白（cadherin，CAD）、氨肽酶N（aminopeptidase N，APN）、堿性磷酸酯酶（alkaline phosphatase，ALP）、腺苷三磷酸結合轉運蛋白（ATP-binding cassette transporter，ABC）等[9-15]。ABC轉運蛋白家族蛋白包含4個核心結構域：兩個跨膜結構域（TMD），每個結構域由6個跨膜螺旋組成；兩個位于胞質側的核苷酸結合區（NBD），與兩個跨膜結構域交替。ABC轉運蛋白的功能與細胞物質轉運和相關物質的代謝有關[16-18]，已有報道表明，ABC轉運蛋白不僅是Bt的受體，而且ABC基因的突變或表達量的改變與昆蟲對Bt產生抗性相關[14-16]。【本研究切入點】前期研究表明，對Bt蛋白敏感棉鈴蟲（）的發生突變，造成翻譯的蛋白序列提前終止，HaABCC2蛋白功能喪失，會導致棉鈴蟲對Cry1Ac蛋白抗性的產生[14]。ABC轉運蛋白是一個龐大的家族，且在細胞膜上以多種ABC的形式混合存在，因此研究其他ABC在Cry1Ac殺蟲機制及棉鈴蟲對Cry1Ac抗性機制中的作用很有必要?！緮M解決的關鍵問題】明確棉鈴蟲HaABCC1是否為Cry1Ac的功能性受體蛋白，表達量的變化是否與棉鈴蟲對Cry1Ac的抗性有關，進一步揭示Cry1Ac的殺蟲機制及棉鈴蟲產生抗性的分子機制，為合理應用Bt及轉基因抗蟲作物、制定合理的抗性治理策略提供理論依據。

1 材料與方法

試驗于2017—2018年在中國農業科學院植物保護研究所植物病蟲害生物學國家重點實驗室完成。

1.1 供試昆蟲

棉鈴蟲新鄉敏感品系（96S）：1996年6月采自河南省新鄉縣棉田，在實驗室內用人工飼料[19]飼養至今，未接觸過任何殺蟲劑。敏感棉鈴蟲品系在昆蟲飼養間以溫度（27±2）℃，光周期14L﹕10D，相對濕度（75±10）%的條件下飼養。成蟲在產卵籠中飼養并用10%蜂蜜水補充營養。

棉鈴蟲Cry1Ac抗性品系（BtR）：室內用3.6 mg·mL-1Cry1Ac原蛋白對96S敏感品系篩選了210代，抗性倍數為3 600倍[20]。

1.2 Cry1Ac蛋白

活化的Cry1Ac蛋白購于北京樂士寧科技有限公司（Envirologix）。生物素標記試劑盒購于武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司（Elabscience）。用生物素標記活化的Cry1Ac蛋白，標記過程參考試劑盒說明書。

1.3 取樣方法

收集敏感品系（96S）與抗性品系（BtR）棉鈴蟲5齡幼蟲各10頭，在冰上解剖，去除食物截取中腸，用4℃預冷的0.7% NaCl溶液將內含物沖洗干凈，再用濾紙吸干水分，-80℃保存備用。

1.4 總RNA的提取與cDNA的合成

按照Invitrogen操作說明分別提取各樣品總RNA，RT-PCR和熒光定量RT-PCR所用的cDNA模板的合成參照Tiangen公司Fast QuantRT kit說明書和SuperRealPreMix（Probe）說明書。所有樣品設3次生物學重復。

1.5 原核表達及Ligand blot分析

利用Primer 5.0軟件分別設計兩個跨膜區（TMD）攜帶酶切位點RV和dⅢ的引物（表1），名稱分別為TM1-RV-F、TM1-dIII-R；TM2-RV-F、TM2-dIII-R。把PCR合成的目的基因轉入克隆載體，取測序正確的質粒和表達載體pET32a進行雙酶切，用T4-DNA連接酶將目的片段和表達載體構建為重組質粒。將測序正確的重組質粒轉入BL21（DE3）感受態細胞中并轉接500 ml LB培養基中培養，加入0.8 mmol·L-1IPTG并在25℃過夜誘導表達。高速低溫離心收集菌體并超聲破碎，經SDS-PAGE電泳并切取目的片段送至北京華大蛋白質研發中心進行質譜檢測。并用購于生工生物工程有限公司的PAGE膠蛋白微量回收試劑盒回收目的蛋白。

用Ligand blot檢測原核表達得到的HaABCC1兩個跨膜區片段蛋白能否與活化的Cry1Ac在體外結合。將純化蛋白經過電泳轉到PVDF膜上；加入30 ml封閉液到自封袋中并放入PVDF膜，置于搖床上80 r/min室溫孵育2 h；重新加入新的30 ml脫脂牛奶再加入5 μl生物素標記的活化Cry1Ac，置于搖床上80 r/min孵育1 h；重新加入20 ml脫脂牛奶再加入2 μl二抗（HRP標記的山羊抗小鼠抗體）到自封袋中，室溫孵育1 h，PBST洗膜3次，每次10 min；用ECL方法進行曝光，所用的試劑盒為EASYsee底物發光液。

1.6 RNAi及生物測定

利用RNAi干擾敏感品系（96S）棉鈴蟲的。為了提高RNAi干擾的特異性，從高特異性的跨膜區片段設計siRNA序列。并用加強熒光蛋白基因（）作為對照。siRNA由生工生物工程有限公司合成（表1），名稱分別為siRNA-ABCC1和siRNA-EGFP。

用5 μl微量注射器往3齡初棉鈴蟲幼蟲的腹部注射2 μg·μl-1的siABCC1 1 μL。注射點用凡士林封閉，防止體液過多流失。用不被注射的棉鈴蟲以及注射siEGFP和DEPC水的棉鈴蟲作為對照。每個處理24頭棉鈴蟲，進行3次重復。干擾后48 h利用熒光定量RT-PCR檢測不同處理棉鈴蟲的表達量。

采用生物測定的方法測定Cry1Ac對干擾棉鈴蟲后死亡率的變化。往24孔板的每個孔中加入1 ml剛制作完成的棉鈴蟲人工飼料（液態）。待其凝固后往每個孔中加入75 μl活化的Cry1Ac蛋白使每個孔中蛋白濃度為120 μg·cm-2。接入干擾處理48 h后的棉鈴蟲，每個處理24頭，3次重復。以加入等量的PBS溶液為對照處理。5 d后，統計各處理的死亡蟲數，計算相應的死亡率[21]。

1.7 細胞轉染及細胞生物測定

利用Primer 5.0軟件設計帶酶切位點I和I的全長引物ABCC1-I-F和ABCC1-I- R（表1）。經PCR測序鑒定正確的質粒通過雙酶切和T4-DNA連接酶連接到pAc5.1b質粒上，構建重組質粒pAc-ABCC1。質粒購于北京華越洋生物有限公司。

將Sf9細胞分別平鋪到12孔板中，每孔約9×105個細胞，放到28℃培養箱讓細胞充分貼壁（2 h）。在Cellfectin（Invitrogen；8 μl/孔）作用下，每個孔里轉染2 μg pAc5.1b（對照，空質粒）或目的基因質粒，孵育5 h。用1.5 ml Sf-900 II SFM培養基（Sf9細胞）置換轉染液，然后放至28℃培養箱培養64 h。在每次獨立的轉染試驗中，細胞被吹起，重新平鋪到96孔板的3個孔中，每孔100 μL含細胞10 000個。充分貼壁2 h后，用活化的Cry1Ac處理轉染細胞，活化的Cry1Ac濃度為18.5 μg·ml-1。每個質粒被重復3次轉染到細胞中，每次獨立的轉染用活化的Cry1Ac進行3次重復的生物測定。對細胞生物測定后，Sf9細胞提取RNA并反轉錄為cDNA，用特異性引物ABCC1-F’和ABCC1-R’（表1）進行PCR驗證，檢驗pAc-ABCC1重組質粒是否成功轉入Sf9細胞中。

1.8 氨基酸序列對比分析

根據Genbank中的cDNA序列（KY796050），用Primer 5.0軟件分別設計ABCC1-F和ABCC1-R引物（表1），以抗、感棉鈴蟲5齡中腸的cDNA為模板，進行PCR擴增，分別擴增出序列。按下列程序啟動PCR：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸5 min，共35個循環；72℃保溫10 min。PCR反應所用的高保真聚合酶購于賽默飛世爾科技（中國）有限公司（Thermo Fisher）。擴增完成后用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，利用AxygenDNA回收試劑盒回收目的條帶，然后把回收產物克隆到Peasy-T3載體上，轉化入Trans1-T1感受態細胞中，挑取陽性單克隆送北京博邁德（Biomed）進行序列測定。PCR獲得基因全長并經Blast序列比對確認為后，用DNAMAN分別對比其對應的氨基酸序列。

1.9 熒光定量RT-PCR

利用TaqMan探針技術進行熒光定量RT-PCR，根據的cDNA序列設計、合成用于熒光定量RT-PCR的特異性引物和探針，以棉鈴蟲（GenBank：JF417983.1）和-（GenBank：EU527017.1）作為雙內參基因，合成特異性引物和探針，探針5′端采用FAM標記，3′端采用BHQ標記。引物和探針在上海Invitrogen公司合成（表1）。在20 μL熒光定量RT-PCR反應體系中含有：2× SuperReal Premix 10 μL正向引物（10 μmol·L-1）0.6 μL，反向引物（10 μmol·L-1）0.6 μL，熒光探針（10 μmol·L-1）0.4 μL，cDNA模板1 μL，50×ROX ReferenceDye 0.2 μL，RNase-Free ddH2O 7.2 μL?；靹螂x心后在ABI 7500熒光定量RT-PCR儀上按照如下條件反應：95℃預變性15 min，然后95℃變性3 s，60℃退火/延伸32 s，共40個循環。反應中以水作為陰性對照，每個處理3個技術重復。

1.10 數據處理

對熒光定量RT-PCR結果采用2-ΔΔCt法進行計算[22]。采用SPSS軟件對處理數據進行分析，處理間比較采用單因素方差分析檢測，用Turkey法進行多重比較。

表1 各RT-PCR、熒光定量RT-PCR及RNAi反應所用引物

2 結果

2.1 HaABCC1跨膜區原核表達及Ligand blot分析

通過PCR技術，經過測序驗證成功克隆得到HaABCC1跨膜區TMD1（924 bp）和TMD2（882 bp），并在BL21（DE3）感受態細胞中成功原核表達，蛋白片段大小分別為34和33 kD，與預期結果相符（圖1-A）。經過Ligand blot檢測，HaABCC1跨膜區原核表達片段均能與活化的Cry1Ac蛋白結合（圖1-B）。

2.2 HaABCC1功能驗證

被干擾后，相較于未注射的棉鈴蟲以及注射DEPC水和siEGFP的棉鈴蟲，的表達量分別下降了54.0%、49.4%和52.2%（＜0.05）（圖2-A）。被干擾后的棉鈴蟲，除表達量明顯降低外，幼蟲對Cry1Ac的敏感性也發生顯著改變。用活化的Cry1Ac蛋白處理被干擾的棉鈴蟲，與未注射的棉鈴蟲以及注射DEPC水和siEGFP的棉鈴蟲相比，其幼蟲死亡率分別下降了65.9%、60.0%和62.2%（＜0.05）（圖2-B）。

A：Marker：蛋白標準品protein marker；1：超聲破碎處理后TMD1片段TMD1 fragment after ultrasound treatment；2：超聲破碎處理后TMD2片段TMD2 fragment after ultrasound treatment。B：1、4：蛋白標準品protein marker；3、6：BSA蛋白，作為對照BSA, as a control；2：TMD1片段與活化的Cry1Ac蛋白結合TMD1 fragment bound with Cry1Ac；5：TMD2片段與活化的Cry1Ac蛋白結合TMD2 fragment bound with Cry1Ac

與轉入pAc空質粒的Sf9細胞相比，可以看到棉鈴蟲pAc-ABCC1被成功導入Sf9細胞中（圖3-A）。用18.5 μg·ml-1的活化Cry1Ac蛋白處理成功轉入的Sf9細胞，結果發現細胞的死亡率顯著上升（＜0.05）（圖3-B），為33.8%，顯著高于未轉入的Sf9細胞的細胞死亡率（2.0%）。

2.3 抗、敏品系棉鈴蟲HaABCC1的cDNA及氨基酸序列對比分析

比較Cry1Ac抗性棉鈴蟲與敏感棉鈴蟲的全長，發現在Cry1Ac抗性品系（BtR）和敏感品系（96S）棉鈴蟲只有少數堿基的差異，在氨基酸水平上沒有任何差異。

2.4 抗、敏品系棉鈴蟲HaABCC1的mRNA表達量分析

進一步比較了在抗性品系（BtR）和敏感品系（96S）棉鈴蟲中表達量的差異，發現在抗性品系棉鈴蟲中的表達量顯著降低（＜0.05），敏感品系的表達量是抗性品系的4.19倍（圖4）。

柱上不同小寫字母表示處理間差異顯著（P＜0.05）。下同

3 討論

昆蟲中腸上皮細胞刷狀緣膜囊泡BBMV上的受體與活化的Bt蛋白特異性結合在Bt殺蟲機制中起著關鍵作用[23-24]。已經有相關報道證實ABC轉運蛋白是Bt蛋白的受體。例如，Zhou等[15]通過蛋白質體外結合試驗，發現Cry1Ac能與ABCC2結合；TanakA等[25]在昆蟲細胞內分別表達突變型（酪氨酸插入）和野生型家蠶的，通過分析細胞對Bt的敏感性變化發現參與了Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1Fa和Cry8Ca的殺蟲過程；Chen等[26]通過在昆蟲細胞系表達斜紋夜蛾（Sl-HP），證實其為Cry1Ac的功能受體。本研究選擇在HaABCC1轉運蛋白中特異性較高的兩個跨膜結構域，通過在大腸桿菌中原核表達得到了兩個HaABCC1跨膜結構域蛋白，通過Ligand blot分析確定這兩個跨膜區片段蛋白均能與Cry1Ac在體外結合。被干擾后棉鈴蟲對Cry1Ac的敏感性顯著降低，而且在Sf9細胞中表達能夠提高Cry1Ac處理后的細胞死亡率。這些結果表明HaABCC1是Cry1Ac的特異性結合蛋白，可能是Cry1Ac的功能性受體蛋白。

A：PCR檢測pAc-ABCC1質粒轉入Sf9細胞Confirmation of HaABCC1 expression in cells transfected with pAc-ABCC1 by PCR。1—9：轉入pAc-ABCC1質粒的Sf9細胞（3個生物學重復× 3個技術重復）pAc-ABCC1 plasmid transfected into the Sf9 cell line (3 biological replicates × 3 technical replicates)；10—18：轉入pAc空質粒的Sf9細胞（3個生物學重復× 3個技術重復）pAc empty plasmid transfected into the Sf9 cell line (3 biological replicates × 3 technical replicates)。B：用活化的Cry1Ac蛋白處理轉入pAc-ABCC1質粒和轉入pAc空質粒的Sf9細胞死亡率The mortality of Sf9 cells exposed to Cry1Ac after transfected with the pAc-ABCC1 or pAc empty plasmid

圖4 HaABCC1在不同品系中的表達量

前期研究發現，在棉鈴蟲不同發育階段均有表達，在4齡、5齡幼蟲中表達量最高，在成蟲中最低；在不同組織中均有表達，在馬氏管中表達量最高，在前腸中最低。這可能與ABC轉運蛋白家族的功能相關，如在哺乳類動物中ABC轉運蛋白參與離子運輸和毒素分泌的過程，能夠將不同的外源物質、重金屬等運輸到體外，因此具有抵御抗體、化學治療藥物和農藥的功能[27]。近年來，關于ABC轉運蛋白的變化與昆蟲對Bt的抗性關系也受到普遍關注。如鱗翅目昆蟲的ABCB、ABCD、ABCE、ABCF之間存在一定的同源性且與昆蟲對Bt的抗性有關[28]；敏感棉鈴蟲的發生突變，造成其翻譯的蛋白序列提前終止，HaABCC2蛋白功能喪失，這會導致棉鈴蟲對Cry1Ac蛋白抗性的產生[14]；小菜蛾（）突變會引起其對Cry1Ac蛋白抗性的產生[29]；小菜蛾被干擾后，會顯著提高其對Cry1Ac蛋白的抗性[30]；棉鈴蟲的突變會引起棉鈴蟲對Cry2Ab蛋白的抗性[31]。本研究發現，雖然Cry1Ac抗性棉鈴蟲編碼的氨基酸序列沒有發生變化，但與敏感品系相比，抗性品系棉鈴蟲的表達量顯著降低，推測表達量的降低可能與棉鈴蟲對Cry1Ac抗性的產生相關。

由于棉鈴蟲HaABCC1蛋白具有與其他ABC蛋白家族相似的結構，含有2個跨膜結構域和2個膜外區域，含有14個N-糖基化位點和16個O-糖基化位點。尤其是2個富含糖基化位點的跨膜結構域可能與Bt殺蟲作用及昆蟲對Bt的抗性相關。有關ABCC2在Bt殺蟲機理中的作用，Gahan等[32]推測Cry蛋白與ABCC2結合可能是形成寡聚體的基礎，并把穿孔前的結構拉近到跨膜區以便于穿孔；Tanaka等[25]研究發現，在細胞內共表達鈣黏蛋白（CaLP）和ABCC2，共表達后的細胞比僅表達ABCC2時更大；類似地，在Sf9細胞中共表達HevABCC2（）和HevCaLP，對細胞有更高的毒性；而Tay等推測ABCA2可以獨立參與Cry2Ab的作用模型，來完成結合和穿孔[31]；真核表達抗、感家蠶，結果表明該基因協助穿孔[33]；的修飾和敲除可能阻礙了Bt蛋白作用機制的最后一步[24]。基于不同ABC轉運蛋白之間相似的結構，棉鈴蟲ABCC1也可能與其他ABC轉運蛋白一樣，兩個跨膜結構域的變化可能與昆蟲對Bt的抗性相關。但本研究并沒有發現HaABCC1兩個跨膜結構域的氨基酸序列發生改變，全長氨基酸序列也沒有變化，僅表達量發生了改變。由于ABC蛋白是一個龐大的家族，且在細胞膜上也混合存在，有可能是很多種蛋白共同起作用。因此，筆者推測ABCC1可能和其他ABC家族蛋白或與其他受體蛋白共同在Bt殺蟲機制及抗性機制中起作用。

Tay等[31]利用EPIC（exon-primedinton-crossing）技術和目的基因的測序技術，通過雙向遺傳連鎖分析了抗Cry2Ab棉鈴蟲，發現其抗性的產生是由于ATP結合盒轉運體基因上的3個與抗性相關的INDEL的突變而引起，且和的突變與棉鈴蟲對Cry2Ab的抗性相關；Xiao等[14]也報道了的突變引起棉鈴蟲對Cry2Ab的抗性。前期研究發現被干擾后，棉鈴蟲對Cry2Ab的敏感性顯著降低，推測ABCC1也是Cry2Ab的功能性受體蛋白[34]。上述結果表明，ABC轉運蛋白可能不僅是Cry1A的受體蛋白，也是Cry2A的受體，這些共同的受體是否與Cry1A和Cry2A類蛋白間的交互抗性相關，有待進一步研究。

4 結論

原核表達的兩個棉鈴蟲HaABCC1跨膜區片段蛋白均能與Cry1Ac在體外結合；被干擾后，能顯著降低Cry1Ac對棉鈴蟲的毒力；將導入Sf9細胞后能顯著提高Cry1Ac處理后的死亡率；與敏感品系相比，Cry1Ac抗性品系表達量顯著降低。因此，HaABCC1可能是Cry1Ac的功能受體蛋白，并可能參與對Cry1Ac的抗性機制。

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Effect of Midgut Specific Binding Protein ABCC1 on Cry1Ac Toxicity against

CHEN Lin1, WEI JiZhen2, LIU Chen1, NIU LinLin1, ZHANG CaiHong1, LIANG GeMei1

(1State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests, Institute of Plant Protection, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193;2College of Plant Protection, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002)

【】The objective of this study is to research the bindingcharacteristics of midgut protein ABCC1 from(HaABCC1) to Cry1Ac and the effect of ABCC1 on toxicity of Cry1Ac, and to clarify the role of HaABCC1 in the insecticidal mechanism of Cry1Ac. 【】To verify the binding ability of HaABCC1 with Cry1Ac, the sequence ofwas analyzed and the primers were designed, two heterologously transmembrane protein fragments of HaABCC1 were expressed, and then Ligand blot experiment was conducted. The changes of expression level ofand mortality of larvae exposed to Cry1Ac were tested after silencedby microinjected siRNA into the abdomen of 3rd instar larvae. The cell mortality changes of sf9 insect cell line treated by Cry1Ac were compared using cell bioassay method, after transfectedinto sf9 and confirmed the pAc-ABCC1 recombinant plasmid was successfully transferred into sf9. The difference of full-lengthbetween Cry1Ac-resistant strain (BtR) and susceptible strain (96S) was compared, the expression of【】The two HaABCC1 transmembrane fragments, TMD1 and TMD2, were successfully expressed inBL21 (DE3) cells, these two heterologously expressed HaABCC1 fragments could bind to actived-Cry1Ac. The expression level ofsignificantly reduced after injection ofsiABCC1 into abdomen of thelarvae. Compared with non-treated, DEPC water- and siEGFP-injected larvae, the mortality oflarvae which were knocked downsignificantly decreased after treated with actived-Cry1Ac. It was showed the toxicity of Cry1Ac againstlarvae significantly reduced after thesilence. Compared with sf9 control, the mortality of cell line whichexpressed in sf9 obviously increased after treated by actived-Cry1Ac. The result indicated that transfectioninto sf9 could significantly increase the cell mortality after Cry1Ac treatment. There was no difference in the cDNA sequence and amino acid sequence ofbetween susceptible strain (96S) and Cry1Ac-resistant strain (BtR), but the expression level ofsignificantly reduced in BtR resistant strain compared with 96S susceptible strain.【】HaABCC1 ofis a specific binding protein and may be a functional receptor protein of Cry1Ac, it may involve in the resistance ofto Cry1Ac.

; ABCC1;; Cry1Ac; binding protein; toxicity

10.3864/j.issn.0578-1752.2019.19.005

2019-04-23；

2019-05-27

國家轉基因生物新品種培育重大專項（2016ZX08011-002）

陳琳，E-mail：chenlincaas@126.com。

梁革梅，E-mail：gmliang@ippcaas.cn

（責任編輯 岳梅）