馬鈴薯組織培養技術

劉志強

一、馬鈴薯的組織培養

1、種薯的莖尖脫毒

植物組織培養也叫PlantTissueCulture，廣義指在特定條件下，植物生長過程中，將離體的植物組織、細胞或原生質體，通過人工培養手段，促進其分化與生長，并在環境與技術的控制下，促使植物完成完整植株，過程生產次生代謝物質的技術。因為組織培養過程需要脫離母體完成，因此植物組織培養也叫離體培養。狹義指特定條件下，植物中的形成層、葉肉組織、薄壁組織、胚乳等部分，通過培養技術產生的植株，也是對植物器官組織的再培養，通過分化過程變成新的植物。

選擇產量較高或抗病能力較強的塊莖洗凈后，在32℃下催芽或自然發芽。當塊莖出芽長約30厘米時，切取帶頂芽或側芽的莖段約10～15厘米備用。將莖尖先用自來水沖洗干凈后，用75%的酒精浸泡30s，再用0.1%升汞浸泡8～10min，然后用無菌水沖洗3～4遍后，在顯微鏡下剝取帶兩個葉原基的莖尖接種到裝有脫毒培養基的試管斜面上，每個試管內接種一塊愈傷組織，在25℃左右的培養室進行培養。脫毒培養基一般為MS培養基中加入0.5mg·L-16-BA、0.1mg·L-1GA3和0.1mg·L-1NAA。觀察其生長狀況，剔除污染及未成活的試管苗。

2、試管苗擴繁

配制好MS培養基后，趁熱分裝入三角瓶中，進行高壓滅菌。觀察3～5天，剔除污染的試管后，準備接種。將工作服、套袖、剪刀、鑷子、培養皿等進行高壓滅菌。將拖鞋及滅菌好的工作服放入緩沖間，對接種室的空間進行熏蒸消毒，每接種一個星期左右熏蒸一次。將盛裝75%的酒精瓶放在超凈工作臺附近，在工作臺內放入酒精燈、打火機、浸泡的酒精棉球、滅菌器等所需物品，每次接種前需將超凈工作臺用紫外燈進行殺菌半小時左右，20min后工作人員方可進入。

接種人員先換上拖鞋、剪掉手指甲、用香皂洗凈雙手后，進入到緩沖間內。換上拖鞋及工作服后，進入接種室，用75%的酒精對雙手、套袖進行噴霧消毒，然后就座于超凈工作臺前，點燃酒精燈，用酒精棉球對雙手及臺面進行消毒，將試管先用酒精棉球擦拭，然后用酒精燈輕微灼燒試管口及棉塞，在酒精燈火焰下10cm以內拔掉棉塞，將鑷子在酒精燈火焰下灼燒，帶晾涼后夾出試管苗，用剪刀剪掉剩余培養基后，將試管苗放在培養皿內，培養皿在酒精燈附近10cm內。將剪刀進行酒精燈火焰灼燒晾涼后，用剪刀將試管苗剪為數段，每段要留1片小葉。將帶有培養基的三角瓶先用酒精棉球擦拭，然后在酒精的火焰下對瓶口進行消毒，稍涼片刻，用鑷子將試管苗在酒精燈火焰下10cm以內接入到三角瓶內，每瓶接種10段左右，火焰封口后，貼上標簽，標簽上要標注接種時間、品種及接種人。重復此操作直至將培養皿內的苗全部接完后，將培養皿用酒精棉球擦拭，在酒精燈火焰下灼燒后放回原處，進行下一個試管苗或另一個品種的接種操作。

接種結束后，將接種好的三角瓶放到培養室內培養，25℃左右，每天用照明燈補光，光照16h，觀察其生長狀況，剔除污染及未成活的試管苗。一個月左右后進行下一次組織擴繁。

3、壯苗及生根培養

馬鈴薯組織培養時，增加細胞分裂素濃度，可以促進增殖系數的提升。但隨著增殖系數的增多，會抑制增殖芽的生長趨勢，不定芽更加細小，不能進行下一步生根培養;即使可以進行下一步，成活率也會降低，還需另外進行壯苗培養。馬鈴薯的壯苗培養基為1/3MS+0.05mg·L-1NAA。

生根培養是使無根苗生根形成完整植株的過程，這個過程的目的就是使組培苗生長出濃密而粗壯的不定根，以提高組培苗對外界環境的適應力及馴化移栽的成果率，獲得更多高質量的商品苗。馬鈴薯組培苗的生根培養是將未生根的組培苗轉接入生根培養基中繼續培養使其生根的過程。馬鈴薯的生根培養基為1/2MS+0.20mg·L-1NAA，適當加大植物生長素的用量，使其快速生根。

4、煉苗及移栽

馬鈴薯組培苗經過生根培養后，便可出瓶移栽。移栽后的組培苗需在特定條件下，如無菌條件、營養、溫度、光照、濕度等，都有較高的要求，要想植物移栽后的生長滿足生長條件，就需要人工創造條件。后期還需使用出瓶種植，讓植物接觸自然環境，與人工環境有較大差距，如溫度與濕度等，改變了人為的條件，短時間中組培苗適應不能適應。因此，組培苗必須移出培養室，在室溫下煉苗3-5天。

移栽前一天揭開封口膜。移栽時，小心的用手洗去根部附著的培養基，水溫在22℃左右，去掉培養基的苗再用清水洗兩遍，要求認真細心，避免折斷薯苗，清洗后的薯苗再置于一定濃度的殺菌劑溶液中浸泡5min后，立即移栽。按6～8cm的株距移栽入無土培養的基質上，擺苗要仔細，將苗的根系舒展好，覆土后可稍加鎮壓以提墑。移栽后澆透水，注意遮蔭保濕，基質在使用前要用高錳酸鉀進行消毒，不易過濕，以防爛苗。觀察移栽苗的生長狀況，及時剔除未成活的組培苗，進行種植的常規管理。

二、馬鈴薯組織培養中的污染原因及控制措施

1、組培苗污染

產生組培苗污染的原因很多，如組織培養附近空氣環境清潔度不足、過濾設備設施失效、相關器具與器皿中含有其他菌群、植物操作過程不正確等等。造成組培苗污染的病原有很多，主要有細菌、真菌、內源菌等。其中細菌的污染以芽孢桿菌最為普遍、嚴重，對其處理主要使用高壓滅菌或者消毒手段。組培苗中產生真菌主要是因為主體接觸不干凈的物質，如灰塵而生長的，在此環境下，可以通過提升培養環境與操作環境方法減少真菌產生。另外植物組織培養過程中，內源菌污染的處理工作比較復雜。該污染指外植體材料內部中微生物，此處不能使用一般表面消毒方法清除，主要解決步驟為：①升級外植體的消毒方法，如間隙消毒;②使用前仔細檢查培養物質量，閱讀藥品合格證與使用方法，因為有些污染需在很長時間之后才表現出來，甚至有些污染很難被發現，切記不能使用質量低或者過期藥品做培養基;③適當使用抗生素。

2、組培苗玻璃化

植物組織培養過程中，經常遇見半透明狀的畸形試管苗，對這類植物體叫做“玻璃苗”，此類現象叫做“玻璃化現象”，又稱過度水化現象。組織苗一旦發生玻璃化，其組織結構發生變化，生理功能產生異常，主要體現為分化能力下降，不能獨立增殖成芽或者生根，移栽到自然界中更是很難成活。因此要采取防治手段，主要有下面幾點：①使用固體培養方法，提升瓊脂濃度，減少培養基中襯質勢。通過此方法可減少玻璃化概率;②適當提升培養基中蔗糖比例，降低培養基中的滲透勢，減少植物材料吸收水分量，不會產生水分脅迫;③注意培養基的通氣，如用棉塞，降低培養容器中空氣濕度，優化氧氣供應;④減少培養基中細胞分裂素和赤霉素的濃度;⑤采取低溫處理手段。⑥增加自然光照;⑦增加培養基中Ca、Mg、Mn、K、P、Fe、Cu、Mn元素含量，降低氮氯比例，此處需注意降低銨態氮濃度，但是盡量提升硝態氮含量。

（作者單位：123000遼寧省阜新市產業技術創新推廣中心（市產業技術研究院））