狗棗獼猴桃鋅指蛋白(AkZFP2)的生物信息學分析

李然紅， 陳 鑫， 劉 丹， 王立鳳

(牡丹江師范學院，黑龍江 牡丹江 157012)

狗棗獼猴桃〔Actinidiakolomikta(Maxim.et Rupr.) Maxim.〕，別名狗棗子，常生于東北海拔800～1 500 m和四川海拔1 600～2 900 m山地混交林或雜木林中的開曠地。狗棗獼猴桃是我國較為耐寒的野生果樹之一，葉色在紅、白、綠間變化，變化誘因有待進一步研究，但極具觀賞性，同時果實和葉均可藥用，且狗棗獼猴桃是良好的蜜源植物[1-3]。鋅指蛋白(Zinc finger proteins，ZFP)是一類具有螺旋指狀結構和 Zn2+結合位點的轉錄因子，最早在非洲爪蟾中被發現[4]。根據其保守結構域中半胱氨酸和組氨酸的數目和位置可分為C2H2、C4、C6、C4HC3、C2HC、CCCH等多種類型[5]。鋅指蛋白在轉錄和翻譯水平上調控基因的表達，如Q-type ZFP 可以參與植物的根系調控以響應環境干旱[6]。ZFP參與植物的生長發育、形態建成、逆境脅迫應答等功能[7]。SENDON等[8]研究表明，擬南芥中的Atdwa1鋅指C2H2蛋白能夠影響植株的開花、葉片、矮小的生長發育。OsMSR15在水稻的不同生長發育階段表現出對冷、熱、干旱脅迫具有正調節作用，并在種子萌發期對ABA有超敏感性[9]。ZFP能夠在低溫、干旱、鹽堿等脅迫環境中發揮重要作用，番茄、枳、煙草、大豆中的ZFP均在逆境環境中大量表達，巨桉的EgrZFP6能夠參與脅迫響應的負調控，提高植物對低溫的敏感性[10-11]。目前，植物鋅指蛋白的研究已經取得顯著進展，但有關狗棗獼猴桃基因組中鋅指蛋白基因的研究相對較少。因此，篩選鋅指蛋白的cDNA序列，利用生物信息學方法對狗棗獼猴桃鋅指蛋白的理化性質、跨膜結構、結構功能域、蛋白質修飾位點及同源性等方面進行預測和分析，以期探明ZFP在狗棗獼猴桃應對長期低溫脅迫中發揮的作用。

1 資料與方法

1.1 資料

狗棗獼猴桃鋅指蛋白cDNA序列從牡丹江師范學院植物育種實驗室轉錄組數據中獲得；中華獼猴桃變種(PSS36210.1Actinidia chinensis var.chinensis)、罌粟(RZC69647.1 Papaver somniferum)、牛耳草(KZV33942.1 Dorcoceras hygrometricum)、野李變種(PQQ12403.1 Prunus yedoensis var.nudiflora)、漿果狀辣椒(PHT42171.1 Capsicum baccatum)、土瓶草(GAV59596.1 Cephalotus follicularis)、甜椒(XP_016579619.1 Capsicum annuum)、克萊門柚(XP_006453394.1 Citrus clementina)、蜜柑(GAY37133.1 Citrus unshiu)、蓖麻(XP_002534087.1 Ricinus communis)、陸地棉(XP_016698842.1 Gossypium hirsutum)、雷蒙德氏棉(XP_012474223.1 Gossypium raimondii)、海島棉(PPD80777.1 Gossypium barbadense)、葡萄(XP_010656831.1 Vitis vinifera)、榴蓮(XP_022732478.1 Durio zibethinus)、橡膠樹(XP_021655388.1 Hevea brasiliensis)等16種植物氨基酸序列在NCBI數據庫中下載。

1.2 方法

AkZFP2的理化性質用ProtParam(https://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/ protparam)進行分析；NCBI-CDD進行保守結構域及蛋白家族預測(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/)； NetNGlyc(http://www.cbs.dtu.dk /services/ NetNGlyc/)對N-糖基化位點進行預測；NetOGlyc(http://www.cbs.dtu.dk/ services/NetOGlyc/)對O-糖基化位點進行預測；采用 SOPMA及PredictProtein 數據庫(https://www.predictprotein.org/)對AkZFP2進行二級結構及蛋白質修飾位點預測；使用 SWISS-MODEL(http://swissmodel.Expasy.org/)在線軟件預測蛋白質三級結構。從NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)數據庫中獲得16條不同植物的ZFP氨基酸序列信息，利用MEGA 5.1的Neighbor-joining法構建蛋白質系統進化樹。

2 結果與分析

2.1 AkZFP2的理化性質

經分析表明，AkZFP2基因cDNA全長為854 bp，編碼區(CDS)為cDNA上第185～619個堿基，共編碼145個氨基酸，分子量15 791.31 D，理論等電點為9.23，負電荷殘基總數(Asp+Glu)為11，正電荷殘基總數(Arg+Lys)為15，分子式為C682H1046N208O219S4，總原子數2 159，不穩定指數(instability index,Ⅱ)為63.05，脂肪系數(Aliphatic index)為55.24，親水性(GRAVY)的平均水平為-0.806。說明該蛋白為親水非穩定性蛋白。該蛋白中含量最多的為絲氨酸,占18.6%;含量最少的為纈氨酸，為0.7%(圖1)。通過ProtScale分析預測(圖2)，該基因蛋白的整個肽鏈中均含有親水性和疏水性氨基酸，得分最大值為0.544，在109個氨基酸處；最小值為-2.467，在第87個氨基酸處。從整體分布看，氨基酸的負值多且分值大，根據蛋白質親水和疏水的得分判定該蛋白為親水蛋白。

圖1 AkZFP2基因編碼蛋白質的氨基酸組成

Fig.1 Amino acid compositions of protein encoded by theAkZFP2 gene ofActinidiakolomikta

圖2 AkZFP2的親水/疏水性

Fig.2 Hydrophilicity/hydrophobicity analysis of AkZFP2

2.2 AkZFP2的信號肽及跨膜結構

經SignalP-4.0預測(圖3)，AkZFP2蛋白不含信號肽，同時不存在跨膜結構。

注：C值、S值和Y值分別是原始剪切位點、信號肽和綜合剪切位點的分值。

Note:The C value,S value and Y value were the scores of original shear site,signal peptide and comprehensive shear site respectively.

圖3 AkZFP2的信號肽及跨膜結構

Fig.3 Signal peptide and transmembranne domain of AkZFP2

2.3 AkZFP2的結構域

經AkZFP2保守序列及蛋白家族進行預測(圖4)表明，AkZFP2是ZFP基因家族的ZF-C2H2-6成員(PFAM13912)。

2.4 AkZFP2的二級、三級結構

經對AkZFP2的二級結構進行預測(圖5)，該蛋白形成螺旋、延伸鏈、轉角及無規卷曲的可能性分別為31.72%、13.10%、4.83%和50.34，無二硫鍵和特殊二級結構。用SWISS-MODEL對AkZFP2蛋白進行三級結構的預測(圖6)表明，該結構主要構件為無規卷曲和螺旋，在第38～73個氨基酸中含有鋅指C2H2結構域。

圖4 AkZFP2的蛋白保守序列

圖5 AkZFP2蛋白的二級結構預測

Fig.5 Secondary structure prediction of AkZFP2 protein

圖6 AkZFP2蛋白的三級結構

Fig.6 Tertiary structure prediction of AkZFP2 protein

2.5 AkZFP2的蛋白質修飾位點

經預測，該蛋白內有1個潛在的N-糖基化位點，在第6個(NTSL)氨基酸處。經對O-糖基化位點預測，分數均>0.5預測是陽性，該蛋白內含20個O-糖基化位點。由表1可見，AkZFP2含有1個鋅指C2H2型結構域序列；2個蛋白激酶磷酸化位點、3個酪蛋白磷酸激酶II磷酸化位點、3個十四烷酰化位點、1個酰胺化位點。

表1 AkZFP2蛋白的修飾位點

2.6 AkZFP2的氨基酸序列同源性

AkZFP2氨基酸序列與16種植物的ZFP序列進行同源性比對(圖7)表明，狗棗獼猴桃與中華獼猴桃原變種的親緣關系較近，而與羅布斯塔咖啡、蓖麻等植物的親緣關系較遠。

3 結論與討論

鋅指蛋白是目前真核生物中分布最為廣泛的一類蛋白，在植物抵抗逆境脅迫中扮演重要角色。C2H2型鋅指蛋白則是成員最多且研究較深入的一類，并擁有高保守的結構域，可通過與特定基因的DNA結合或特異性互作，從而影響植物的抗性功能及生長發育方面的調節[12]。目前已經從多種植物包括擬南芥、大豆、小麥、水稻、矮牽牛等中克隆到ZFP基因，研究的相關材料多為草本植物，藤本植物的ZFP基因研究未見報道。研究發現，ZFP基因在植物發育過程中起重要作用，擬南芥中ZFP基因缺失可導致植物腺毛數量下降，此外植物矮化、花枝退化都與ZFP基因相關[13-14]。ZFP基因其重要功能是與抗性相關，在干旱、鹽、冷、外源激素脅迫中均發揮作用[15]。狗棗獼猴桃是東北地區抗逆性較強的植物，研究其ZFP基因與抗逆性功能關系，為進一步研究狗棗獼猴桃鋅指蛋白基因功能提供了理論基礎。結果表明：AkZFP2基因cDNA全長為854 bp，編碼蛋白由145個氨基酸構成，不含跨膜結構，絲氨酸含量較高，屬于ZF-C2H2-6蛋白家族(PFAM13912)，親水性非穩定蛋白，結構中含有QALGGH高保守結構，狗棗獼猴桃與中華獼猴桃原變種的親緣關系較近，而與蓖麻等植物的親緣關系較遠。

圖7 ZFP系統進化樹

Fig.7 System phylogenetic tree of ZFP