超高效液相色譜指紋圖譜法在雷山銀球茶品質鑒別上的應用

胡 毅， 王 微， 劉文鋒， 鄢人雨， 何 潔， 潘承丹

(1.黔東南州農產品質量安全檢測中心， 貴州 凱里 556000; 2.貴州大學， 貴州 貴陽 550001)

我國茶文化博大精深，源遠流長，茶葉種類眾多[1]。按照成品茶葉形狀分類可分為卷曲形茶、扁形茶、針形茶、磚茶、條形茶、珠茶以及球形茶等[2-3]。不同類型茶葉的產地較多，但是球形茶目前就只有雷山銀球茶[4]。雷山銀球茶在1982年由毛克翕先生研制而成[5]，是貴州省雷山縣特產，中國國家地理標志產品。雷山銀球茶是全國獨一無二的特型茶，加工技術獲多項國家專利[6]，其表面銀灰墨綠，含硒量高達2.00～2.02 μg/g，是一般茶葉平均含硒量的15倍左右，其利用高山茶葉果膠豐富特點，不加任何添加劑，手工制成一種不同于坨茶、磚茶的球狀茶，沖4～5次水余香猶濃，茶水微黃清澈，飲之醇香而微甜。茶葉的質量主要涵蓋三部分，即感官指標、理化指標和衛生指標。茶葉品質通過感官審評來進行，具有一定的局限性，尤其是對我國國家地理標志保護的原產地茶和各種名茶，說服力不足，不能全面客觀地反映茶葉的品質[7-8]。指紋圖譜是一種綜合、可量化的質量控制手段，近年來在茶葉品質鑒定、真偽鑒別、品種和產地識別等方面的應用越來越廣泛[9-12]。由于產地偏遠、知名度較弱，目前對雷山銀球茶的研究較少，對雷山銀球茶的鑒別缺乏有效的方法。雷山銀球做為綠茶與其他綠茶具有很高的相似度，不易區分。為此，筆者等應用超高效液相色譜指紋圖譜法分析7個雷山銀球茶樣品，對雷山銀球茶中水溶性成分進行測定，并與其他綠茶進行對比分析，以期為雷山銀球茶的鑒別和質量控制提供理論依據。

1材料與方法

1.1試驗材料

茶葉樣品：7個雷山銀球茶(L1～L7)，取自雷山縣茶企業； 2個綠茶(Z1，Z2)取自其他茶企業。試驗采用的茶葉均為2018年生產，其生產信息見表1。

表1 茶葉樣品生產信息

儀器與設備：Waters超高效液相色譜儀[Waters PDA 檢測器，色譜柱Waters PEH C18，并配有Waters PEH C18預柱 沃特世科技(上海)有限公司]，數控超聲清洗機(上海冠特超聲波儀器有限公司)，分散機(德國IKA)，離心機(TG-16-WS 湖南湘儀)，電子天平(JY5002 上海舜宇恒平)，電熱恒溫水浴鍋(北京中興偉業儀器有限公司)。

1.2方法

1.2.1檢測方法

1) 樣品前處理。稱取1.000 g粉碎茶樣(過40目篩網)于100 mL錐形瓶中，加入90℃的超純水100 mL，立即放入90℃水浴中超聲提取20 min。提取完成后，靜置，冷卻至室溫，4 500 r/min離心5 min后取上層清液，過0.45 μm濾膜，待測。

2) 色譜條件。色譜柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18 (2.1 mm×100 mm×1.7 μm)，柱溫30℃，進樣量：2 μL。檢測器：二極管陣列檢測器，檢測波長210 nm。流動相：溶劑A，0.01%磷酸水溶液，溶劑B：乙腈。洗脫程序見表2。

表2 超高效液相色譜梯度洗脫程序

1.2.2精密度、準確度及空白試劑干擾性根據1.2.1檢測方法處理樣品6個重復并測定，得到6次重復的目標色譜峰保留時間和峰面積，分別計算其相對標準偏差(RSD)。

1.2.3指紋圖譜的構建和相似度評價按照已建立的UPLC分析方法，對7個雷山銀球茶樣品進樣分析，將所提到的雷山銀球茶色譜圖CDF原始文件導入中藥指紋圖譜相似度評價系統(2012版)，得到7個雷山銀球茶樣本的指紋圖譜，并進行相似度評價分析。

根據中藥指紋圖譜相似度評價系統分析，將各色譜峰的保留時間與同一圖譜中參照峰的保留時間比較，其比值為各色譜峰的相對保留時間；各色譜峰按相對保留時間一一匹配后，選擇 90% 以上樣本共有的峰為樣本集的共有峰[13-14]。

1.2.4水溶性成分分析按照 1.2.1中的方法進行所有茶葉樣品前處理得到上機液，再按 1.2.2 色譜條件，進樣2 μ L ，連續進樣 3 次，通過對照標準品比對，確定化合物。運用外標法根據峰面積平均值，計算各茶葉中已知成分的含量。

1.2.5主成分分析主成分分析是將多個變量通過線性變換以選出較少個數重要變量的一種多元統計分析方法[15]。運用SPSS分析軟件，將多維變量進行降維處理分析，選出最主要的可代表所分析問題的數據，從而使分析問題簡單化。在樣品已知成分定量分析的基礎上，將茶葉中所含的各化合物的含量作為變量，對雷山銀球茶樣品進行主成分分析。

1.3數據分析

試驗數據處理與標準曲線繪制采用 Excel 2007 進行分析，采用 SPSS 進行主成分聚類分析。

2結果與分析

2.1方法學考察

經測定，6次重復的色譜峰保留時間和峰面積的RSD范圍分別是0.26%～1.59%和0.63%～3.12%，表明測定方法的精密度和準確度良好，試劑空白對試驗無干擾。

2.2雷山銀球茶指紋圖譜的構建

從圖1可知，7個雷山銀球茶的色譜圖有27個共有峰。從表3可知，雷山銀球茶27個共有峰的平均相對保留時間為0.821～16.006min。 通過對照標準品比對，共確定12種化合物(圖2)，分別是表兒茶素(EC)、表沒食子兒茶素(ECG)、表兒茶素沒食子酸酯(EGC)、表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)、沒食子兒茶素(GC)、沒食子兒茶素沒食子酸酯(GCG)、沒食子酸(GA)、咖啡因(CAF)、兒茶素沒食子酸酯(CG)、茶氨酸、兒茶素和茶堿。

圖1 雷山銀球茶 L1～L7樣品的指紋圖譜

注：峰2為茶氨酸，峰3為GA，峰6為GC，峰7為茶堿，峰9為EGC，峰11為兒茶素，峰12為CAF，峰18為EC，峰19為EGCG，峰21為GCG，峰25為ECG，峰26為CG，其余色譜峰未知。

Note: peak 2, theanine; peak 3, GA; peak 6, GC; peak 7, theophylline; peak 9, EGC; peak 11, catechin; peak 12, CAF; peak 18, EC; peak 19, EGCG; peak 21, GCG; peak 25, ECG; peak 26, CG. The remaining peaks are unknown.

圖2雷山銀球茶UPLC共有峰指紋圖譜

Fig.2 Common peaks from UPLC fingerprints of Leishan Yinqiu tea samples

表3 雷山銀球茶共有峰的平均相對保留時間

2.3雷山銀球茶UPLC指紋圖譜相似度評價

從表4可知，雷山7個銀球茶(L1～L7)與對照品指紋圖譜相似度(共有模式)在0.964～0.984，均值在0.96以上，相似度較高，可見雷山銀球茶的化學成分相似且穩定[16]。2個綠茶(Z1，Z2)與對照品指紋圖譜的相似度分別是0.94和0.947，由于同屬于綠茶類，生產地也較接近，因此在共有模式下相似度也較高[17]。但是，Z1和Z2與L1～L7的相似度在0.861～0.903，可見，綠茶與雷山銀球茶的差別比較明顯。

表4 不同茶葉與雷山銀球茶UPLC指紋圖譜的相似度

2.4不同茶葉水溶性成分含量

從表5可知，L1～L7的表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)和表兒茶素沒食子酸酯含量分別是3.9～8.5 mg/g和5.0～8.1 mg/g ，較Z1和 Z2低(11.1～12.0 mg/g和13.9～15.1 mg/g)；L1～L7的茶氨酸為17.2～21.9 mg/g ，比Z1和Z2高(11.8 mg/g和10.3 mg/g)。因此，雷山銀球茶與綠茶中的表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)、表兒茶素沒食子酸酯和茶氨酸差別較明顯，其余水溶性浸出物含量的差異較小。不同的原料、不同加工方式對茶葉的水溶性浸出物均有影響，由于產地較接近，又同屬于綠茶類，故綠茶(Z1，Z2)和雷山銀球茶(L1～L7)的部分水溶性浸出物較相似。

表5 不同茶葉水溶性成分含量

2.5雷山銀球茶主成分分析

從表6可知，共提取到2個主成分可以概括雷山銀球茶91.811%的成分含量信息。從主成分載荷矩陣(表7)可知，沒食子兒茶素沒食子酸酯、兒茶素、表沒食子兒茶素、沒食子酸、表兒茶素、兒茶素沒食子酸酯在第一主成分上的載荷較大，即與第一主成分的相關系數均較高；其中沒食子兒茶素沒食子酸酯的載荷最高。其次，表兒茶素沒食子酸酯在第二主成分上的載荷絕對值較大，即負相關程度較高；同時茶氨酸在第二主成分上的載荷最大，即相關程度最高。可知，第一主成分為沒食子兒茶素沒食子酸酯，第二主成分為茶氨酸。

表6 雷山銀球茶主成分分析方差貢獻率

表7 雷山銀球茶水溶性成分的主成分載荷矩陣

3結論與討論

雷山銀球茶是貴州省雷山縣的特產，也是中國國家地理標志產品。超高效液相色譜法(UPLC)比HPLC法分離效率更高、分析速度更快、準確率更高，因此試驗應用UPLC測定茶葉中的水溶性浸出物，并結合中藥指紋圖譜相似度評價方法構建雷山銀球茶指紋圖譜，同時對雷山銀球茶及其他綠茶進行相似度評價。結果表明，雷山銀球茶擁有 27個共有峰，通過對照標準品比對，共確定12個化合物。雷山銀球茶的指紋圖譜與對照標準品的相似度(共有模式)在0.96以上；而另外2個生產地較接近的綠茶(Z1，Z2)與雷山銀球茶對比相似度在0.861～0.903；各樣品的水溶性浸出物中，表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)、表兒茶素沒食子酸酯和茶氨酸的含量差異較明顯，其余指標區別較小。主成分得分分析表明，雷山銀球茶的第一主成分為沒食子兒茶素沒食子酸酯，第二主成分為茶氨酸。

表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)是從中國綠茶中提取的一種成份，它是綠茶主要的活性和水溶性成份，是兒茶素中含量最高的組分，占綠茶毛重的9%～13%[18]。茶氨酸為白色針狀體，易溶于水。具有甜味和鮮爽味，是茶葉的滋味的組分[19]。雷山銀球茶(L1-L7)的茶氨酸明顯比綠茶(Z1，Z2)高很多，所以雷山銀球茶口感較甘甜爽口。

綜上所述，運用UPLC法構建雷山銀球茶的特征指紋圖譜，通過相似度、對照品定量分析、主成分分析等得到了較為理想的結果 ，對雷山銀球茶與其他綠茶的鑒別提供了數據支持和參考依據。