伴病理性乳頭溢液的乳腺癌患者癌組織整合素β1的表達及意義

孫全武，杜小平*，郝 杰，時 榮，劉 波，黃海云

(甘肅省人民醫院乳腺外科，甘肅 蘭州 730000)

乳頭溢液是女性患者在乳腺科門診常見就診原因之一[1]。雖然導管內乳頭狀瘤是病理性乳頭溢液(pathological nipple discharge，PND)的最常見病因，但既往研究發現，2.8%～21.3%的女性乳頭溢液患者最終被診斷為乳腺癌[2]，因為當乳腺癌侵犯大導管引起乳管內出血性或導管內乳頭狀癌刺激乳管分泌增加，可出現病理性乳頭溢液。一項meta分析納入3 110名乳頭溢液患者，結果乳腺癌的發病率占18.7%[3]。國內學者研究發現整合素β1高表達與浸潤性微乳頭狀癌的侵襲性和淋巴結轉移密切相關[4]。我們前期通過meta分析發現整合素β1高表達與乳腺癌總生存期低顯著相關[5]， 合 并 風 險 比 HR=1.88， 95%CI(1.46， 2.42)(P＜0.01)；整合素β1高表達與乳腺癌無病生存期降低顯著相關，合并HR=1.63，95%CI(1.17，2.25)(P＜0.01)。目前，以病理性乳頭溢液為首發癥狀的乳腺癌患者病理特征研究較少，本研究采用免疫組化檢測乳腺癌伴病理性乳頭溢液患者癌組織中整合素β1的表達，并選取同期以乳房腫塊或體檢發現異常而就診的乳腺癌病例作為對照，分析整合素β1與臨床病理學特征的關系，探討其對乳腺癌預后的影響。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

自甘肅省人民醫院病案管理系統調閱2006年1月1日—2013年12月31日期間在乳腺外科行手術治療的乳腺癌病例資料。檢索這些患者的臨床資料，包括初診時年齡、絕經狀況、腫瘤大小、是否轉移至局部淋巴結、術后病檢及免疫組化結果、術后復發、遠處轉移及死亡時間。排除隨訪資料不完整、后續在其他醫院復查以及Her-2檢測不確定的患者。以該院收治的112例伴乳頭溢液就診的乳腺癌作為研究對象(PND組)，部分患者查體或影像學檢查可伴有乳房腫塊。選取同期以乳房腫塊或體檢發現異常而就診的112例乳腺癌作為對照組，這部分患者在發病過程以及體格檢查均未見乳頭溢液。在該院病理科調取以上患者標本，所有標本經10%福爾馬林固定及石蠟包埋，采用免疫組化檢測乳腺癌組織中整合素β1的表達。

1.2 方法

1.2.1 病理及免疫組化檢測方法 分析以下臨床因素和病理組織學指標：年齡、腫瘤大小、組織學分級、淋巴結和雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)狀態、人表皮生長因子受體-2(Her-2)狀態等。ER、PR、Ki-67、Her-2為術后常規檢測，數據記錄在病案數據庫。ER和PR免疫組化檢測結果判定參照文獻[6]，Her-2/neu蛋白(+++)陽性表達者直接確定為陽性，(++)陽性表達者進一步行多重熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization，FISH)檢測，根據基因擴增結果確定為陽性或陰性，具體判定標準參照文獻[7]，對于個別Her-2的FISH檢測結果不確定者送其他實驗室進一步核實，確保Her-2檢測結果的準確性。免疫組化用切片厚4μm，抗體為小鼠抗人整合素β1(1∶100稀釋)單克隆抗體(4B7R)，美國圣克魯斯生物科技公司產品。根據常規親和素-生物素-過氧化物酶復合物法(avidin biotin-peroxidase comples，ABC)使用DAKO全自動免疫組化儀染色。免疫組化結果判定參照文獻[8]，根據染色強度(無色0分、淡黃色1分、棕黃色2分、棕褐色3分)，腫瘤細胞膜或核陽性染色百分比(＜10%計 0分、≥10%～25%計 1分、≥25%～50%計2分、≥50%計3分)，染色強度與陽性細胞百分比的乘積≤4分確定為陰性(-)，≥6分確定為陽性(+)。

1.2.2 統計學方法 采用Graphpad prism 7.0軟件繪制生存曲線；其余統計采用SPSS 19.0軟件，率的比較采用Pearson卡方檢驗，Cox風險比例模型分析單因素及多因素對伴乳頭溢液組患者總生存期的影響，Kendall’s tau-b檢驗分析伴乳頭溢液組整合素β1表達與Her-2的相關性；卡方檢驗分析伴乳頭溢液組整合素β1表達與淋巴結轉移以及遠處轉移的相關性，α=0.05為檢驗水準。

2 結果

2.1 研究對象一般資料的對比

伴病理性乳頭溢液組與對照組患者在年齡構成、腫瘤大小、組織學分級以及淋巴結轉移等方面基線值差異均無統計學意義(P＞0.05，表1)，說明兩組患者間具有可比性。

表1 伴病理性乳頭溢液組與對照組患者資料及病理學特征基線值對比(n=112)

2.2 伴乳頭溢液組整合素β1的陽性表達

癌組織整合素β1免疫組化結果見圖1。伴乳頭溢液組整合素β1陽性表達率為14.29%(16/112)，顯著低于對照組陽性表達率25%(28/112)，差異具有統計學意義(χ2=4.073，P=0.044)；伴乳頭溢液組發生淋巴結轉移或遠處轉移時整合素β1陽性表達率明顯高于無轉移者(P均＜0.05)，見表2。

圖1 乳腺癌組織整合素β1免疫組化結果(×200)

表2 整合素β1在伴乳頭溢液組癌組織中的表達情況

2.3 整合素β1表達對乳腺癌預后的影響

Kaplan Meier法生存分析發現，對照組總生存期明顯低于伴乳頭溢液組(HR=1.773，P=0.012)，伴乳頭溢液組整合素β1高表達患者的總生存期明顯低于低表達組(HR=2.573，P=0.023)，見圖2。進一步采用Cox風險模型分析單變量和多變量對伴乳頭溢液組患者總生存期的影響。結果顯示乳頭溢液組整合素β1的表達與Her-2呈正相關(r=0.281，P=0.001)，淋巴結轉移、組織學分級以及整合素β1高表達是影響伴乳頭溢液組乳腺癌患者總生存期的3個獨立危險因素(P均＜0.01)，見表3和表4。

圖2 乳腺癌患者生存曲線圖

3 討論

整合素β1作為黏附分子與腫瘤細胞耐藥有關，最近研究發現，半乳糖凝集素-1與整合素β1的結合通過促進生存素在乳腺癌細胞中的表達而增強了耐藥性[9]。整合素β1與Her-2共享部分信號通路下游分子，如磷脂酰肌醇3-激酶/Akt和細胞外信號調節激酶1/2(ERK1/2)信號通路[10]。Lesniak 等[11]采用小干擾 RNA基因敲低整合素β1的表達，證明整合素β1高表達促進腫瘤細胞增殖是通過活化PI3K/Akt和ERK1/2信號通路活性而起作用。而曲妥珠單抗是通過拮抗Her-2/PI3K/Akt信號活性抑制腫瘤細胞增殖。此外，整合素介導的生長因子受體活化可能進一步觸發其他生存信號機制，并抵消曲妥珠單抗的抗腫瘤作用[11]，所以整合素β1高表達會降低曲妥珠單抗對Her-2陽性乳腺癌的療效。而且整合素β1通過細胞外基質的相互作用活化PI3K/Akt信號通路，保護乳腺癌細胞免受化療[12]或電離輻射誘導的細胞凋亡[13]，所以整合素β1表達不但降低曲妥珠單抗的抗腫瘤作用，而且影響腫瘤細胞對放化療的敏感性，顯著影響乳腺癌的預后。

表3 Cox風險比例模型分析單變量對乳頭溢液組患者總生存期的影響

表4 Cox風險比例模型分析多變量對乳頭溢液組患者總生存期的影響

已有研究[14]證明，整合素可以促進癌細胞遷移和侵襲。整合素β1是整合素家族最廣泛表達于腫瘤細胞的生物標記物，可預測腫瘤患者的臨床過程和預后[15]。本次實驗結果顯示伴乳頭溢液組整合素β1陽性表達率為14.29%(16/112)，顯著低于對照組陽性表達率25%(28/112)，差異具有統計學意義(χ2=4.073，P=0.044)；伴乳頭溢液組發生淋巴結轉移或遠處轉移時整合素β1陽性表達率明顯高于無轉移者(P均＜0.05)；且乳頭溢液組患者整合素β1高表達者總生存期顯著降低，提示整合素β1表達水平越高預后越差。這與整合素β1陽性表達與乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌等預后不良密切相關的結論相符合[15]。早期納入研究的部分患者因交通條件受限以及術后不按時復查，無病生存期數據有偏差，所以，未分析整合素β1高表達對乳頭溢液組患者無病生存期的影響。Lee等[16]研究發現，血管內皮生長因子可以通過上調和(或)活化整合素β1促進血管形成，進一步采用腦微血管內皮細胞實驗顯示，阻斷整合素β1表達后所有血管生成過程均受到抑制(包括黏連、遷移、毛細血管形態發生)，因此，他們提出整合素α6β1與乳腺癌細胞轉移至大腦密切相關。針對整合素β1的靶向治療或許能延緩乳腺癌腦轉移、延長乳腺癌患者總生存期和無病生存期。近來，國外學者曾針對Her-3和整合素β1聯合靶向治療Her-2陽性乳腺癌，發現是一種非常有效的治療措施，且證實了Her-3也是介導Her-2陽性乳腺癌進展的主要因素[17]。今后采用抗Her-2、Her-3以及整合素β1的多靶點治療或許成為Her-2陽性乳腺癌的治療方向。

本研究中，我們發現整合素β1在伴乳頭溢液組的癌組織高表達可顯著降低乳腺癌患者總生存期，可能與乳腺癌轉移密切相關，整合素β1有望成為判定乳腺癌預后的新指標。與其他首發癥狀為主的患者相比，以乳頭溢液為首發癥狀的乳腺癌預后相對較好，如果及時篩查、早發現、早診治，將會顯著提高其治愈率。本次研究的局限性在于納入Her-2陽性乳腺癌例數較少、可能導致研究結果偏倚，統計分析發現其對伴乳頭溢液組患者總生存期無明顯影響。以及出院后的治療依存性等都會影響本次研究結果，所以研究結論尚需多中心大量本試驗進一步證實。今后更嚴格地選擇對曲妥珠單抗治療敏感的患者，盡量減少不必要的藥物毒性，如心臟事件[18]，避免因整合素β1過表達引起曲妥珠單抗治療無效或療效不佳。對于整合素β1過表達的乳腺癌患者，探索新的替代治療策略，如研制針對整合素β1的小分子或抗體抑制劑或許能進一步提高療效、延長總生存期。