云南省新型隱球菌藥物敏感流行病學折點的建立*

樊紅麗，高 麗，楊翠先，張 米，李正倫，杜 艷，劉德華，毛小琴

(1.云南省傳染病醫院/艾滋病關愛中心，昆明 650301；2.昆明醫科大學第一附屬醫院，昆明 650032；3.昆明市第一人民醫院 650011；4.昆明理工大學醫學院，昆明 650500；5.云南省第一人民醫院,昆明 650032)

目前,美國臨床實驗室標準化委員會(clinical and laboratory standards institute,CLSI)對治療新型隱球菌6種常見的抗真菌藥物中，只有5-氟胞嘧啶和氟康唑有藥敏流行病學折點(epidemiologic cutoff value，ECV)。2016年，范欣等[1]對中國人群的新型隱球菌流行病學折點進行研究，選取了中國北京、天津、上海、遼寧、四川等地進行多中心研究，建立了中國人群新型隱球菌的藥敏折點。但是，由于微生物的地區差異性和耐藥機制的變化性，CLSI建議根據標準建立各自實驗室藥敏的參考值范圍[2]。得到ECV的方法有幾種，一種是簡單地繪制最低抑菌濃度(minmum inhibitory concentration，MIC)值的分布圖[3]，是操作者通過視覺設置得到的ECV值。另一種更科學的方法是用MIC95來得到ECV[4],即把95%以上菌株的MIC值包含在內得到的ECV。使用MIC95設置ECV有些問題，比如，如果沒有尾部分布在高端，那么ECV就會設置得很低。因此，產生了一種ECV的計算方法，就是使分布在下端的菌株占比更大[5],即CLSI出版的MIC97.5；就是使97.5%菌株的MIC值包含在內得到的ECV[2]。

本研究選取云南省3家獨立的醫療機構實驗室收集的總共324株新型隱球菌菌株，對6種常用抗真菌藥物：兩性霉素B、5-氟胞嘧啶、氟康唑、伊曲康唑、泊沙康唑、伏立康唑進行藥敏實驗，旨在初步建立云南省新型隱球菌對6種抗真菌藥物的流行病學折點。

1 材料與方法

1.1菌株來源 本研究所使用324株新型隱球菌菌株均分離自2007年1月至2018年8月的臨床艾滋病患者，其中男236例(72.8%)，女88例(27.2%)，年齡34～79歲，平均(44.4±13.2)歲，患者分別來自云南省16個地州。

1.2菌株的復核鑒定 所有菌株經復蘇培養后進行復核鑒定，鑒定方法為使用全自動微生物鑒定儀VITEK2的真菌鑒定卡(YST)進行鑒定。

1.3藥物敏感性實驗 3個獨立的實驗室按照相同的標準，嚴格按照Thermo Fisher公司試劑盒說明書進行藥敏實驗。實驗同時設置標準菌株克柔念珠菌ATCC 6258和近平滑念珠菌ATCC 22019進行質量控制。

1.4野生型菌株的定義及ECV的建立 野生型菌株是指不攜帶任何的獲得性或耐藥機制的菌株[6]。ECV的建立方法根據CLSI M57文件[2]，即MIC97.5。

1.5統計學處理 采用SPSS19.0統計軟件對6種抗菌藥物的MIC菌進行頻數分析。

2 結 果

2.1菌種分布 來自云南省3個不同的實驗室臨床分離的艾滋病合并新型隱球菌感染的324株菌株，經復核鑒定均為新型隱球菌。從標本來源來看，隱球菌菌株更容易透過血腦屏障進入血液和腦脊液，引起臨床癥狀，見表1。

2.2324株新型隱球菌對6種常用抗真菌藥物的敏感性 匯總3個實驗室324株新型隱球菌的藥敏數據，得到其MIC值分布情況，見表2。

表1 324株不同實驗室的新型隱球菌分布情況(n)

-:為無數據

2.3新型隱球菌藥敏的流行病學折點 6種抗隱球菌藥物的MIC值分布基本呈正態分布，但泊沙康唑、伏立康唑、伊曲康唑的MIC分布明顯低于氟康唑，經統計學處理，5-氟胞嘧啶的野生株有14株(4.3%)，兩性霉素B的野生株有5株(1.5%)，伏立康唑的野生株有4株(1.2%)，泊沙康唑和伊曲康唑的野生株分別有2株(0.6%)和1株(0.3%)，氟康唑的野生株有1株(0.3%)。6種抗真菌藥物的流行病學折點為5-氟胞嘧啶8 μg/mL，泊沙康唑0.25 μg/mL，伏立康唑0.12 μg/mL，伊曲康唑0.25 μg/mL，氟康唑16 μg/mL、兩性霉素B 1 μg/mL，見圖1。

表2 324株新型隱球菌MIC值分布情況(μg/mL)

圖1 新生隱球菌菌株MIC值分布、流行病學藥敏折點以及野生型菌株累積百分率

3 討 論

中樞神經系統一旦受到病原菌的侵犯，血腦屏障將會被破壞，導致較高的病死率和致殘率。而在中樞神經系統真菌感染中，由新型隱球菌感染引起的隱球菌性腦膜炎是最常見的。據估計，全球每年約有100萬隱球菌性腦膜炎病例，其中62.5%死亡[7]。隱球菌性腦膜炎常感染免疫力低下人群，尤其是艾滋病患者。近年來，隨著艾滋病患者增多，隱球菌性腦膜炎發生率也顯著上升。隱球菌性腦膜炎病死率較高，如未經治療，病死率為100%，是艾滋病患者死亡的主要原因之一[8]。隱球菌性腦膜炎的治療效果差，病死率高。降低該病病死率主要是降低顱內壓和抗真菌治療兩方面。最常見的抗隱球菌藥物為5-氟胞嘧啶、兩性霉素、氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑和泊沙康唑6種。美國感染學會(DSA)推薦兩性霉素B聯合5-氟胞嘧啶為首選的病原治療方案；同時，唑類藥物作為貫序治療和維持治療[9]。但是，在治療過程中，隱球菌會對抗真菌藥物產生耐藥性,使治療失敗。因此，臨床治療需要有實驗室的體外藥物敏感性報告作為依據。目前,CLSI對治療新型隱球菌6種常見的抗真菌藥物中，只有5-氟胞嘧啶和氟康唑有藥敏ECV。

ECV是基于表型將細菌群體分為無獲得性的耐藥機制和(或)突變性的耐藥機制的MIC值[2]。MIC值是指按照標準操作規程進行真菌藥物敏感試驗時，在特定培養時間內，能完全或顯著抑制真菌生長的最低藥物濃度。不同的方法做出MIC值后計算出來的ECV值是不同的，已經有文獻對一些真菌微生物的ECV進行報道[1-2，10]，然而，這些ECV的數據并不是遵循相同的標準得到。目前制定真菌藥物敏感性實驗，藥敏折點及ECV的發展標準的組織僅有CLSI和歐盟抗生素敏感試驗委員會(European Union Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing，EUCAST)。使用CLSI方法建立的ECV[2]必須包括至少100個不相關分離菌株的MIC值，必須來自至少3個獨立的實驗室,所有的值必須保證用相同的方法檢測，并且室內質控在控的情況下才有效；任何參與實驗室菌株的MIC值不能落在測試所得的MIC范圍最高值或最低值上，這樣才能確保在測試更高或更低的稀釋度時，不會產生低于或高于模式cut/off值。

本研究按照CLSI制定標準，在云南省3家獨立的實驗室，按照相同的標準，使用比色微量稀釋法，對總共324株新型隱球菌菌株進行6種常見抗真菌藥物藥物敏感性實驗，得到云南省新型隱球菌對6種常見抗真菌藥物的MIC值分布情況。根據MIC97.5的MIC值即為ECV值，初步得到云南省新型隱球菌對常見6種抗真菌藥物的ECV，在本研究結果中，泊沙康唑、伏立康唑、伊曲康唑、氟康唑和兩性霉素B與范欣等[1]對中國多中心建立的新型隱球菌的ECV一致，但是5-氟胞嘧啶的ECV低于范欣等[1]的研究結果。同時與文獻[10-11]對全球ECV的研究結果不完全一致，說明不同地區ECV有差異[12-17],推測可能原因是研究對象為艾滋病患者合并隱球菌的菌株，為免疫缺陷的患者分離菌株，患者機體的免疫功能與普通患者的免疫狀態有差異，使其菌株對抗真菌藥物的敏感性也有所差異；也有可能為HIV感染的影響，使得菌株對藥物敏感性有所不同[10]；再者不同的實驗方法對藥物敏感性結果會有差異，最終使得計算的ECV有所不同[10]，提示建立云南省的新型隱球菌ECV至關重要。

在本研究中，發現5-氟胞嘧啶和兩性霉素B的非野生株在6種抗真菌藥物中是較高的，分別占4.3%和1.5%，與ESPINEL-INGROFF等[10]的研究結果新型隱球菌對5-氟胞嘧啶和兩性霉素B的非野生株分別占1.4%～4.3%和0～2.8%相符。其余4種唑類藥物的非野生株低于相關報道[1，11]。推測原因為本研究的菌株來自艾滋病患者，而云南省是艾滋病高發地區，近幾年已從艾滋病的重災區轉變為示范區，對艾滋病的機會性感染特別是新型隱球菌感染診療逐步規范，使得這6種常規抗隱球菌藥物對新型隱球菌的非野生株的占比低于全球性的研究報道。

綜上所述，本研究對云南省艾滋病患者新型隱球菌感染菌株抗真菌藥物的MIC值進行系統描述，初步得到云南省艾滋病患者中新型隱球菌對6種常用抗真菌藥物的ECV，為今后本地區ECV和國家臨床折點的建立提供數據支持。在本研究中還有不足的地方，第一，3個獨立的實驗室提供的菌株不夠均衡，使得單獨一個實驗室的檢測結果對整體結果影響很大，所以本次實驗采用成品試劑盒，最大限度地減少實驗誤差，同時接下來需要再收集多家實驗室的菌株進一步完善檢測并進行分析。第二，新型隱球菌不同變種的ECV也有所不同，本實驗沒有對菌株檢測到變種水平，接下來還需要完善變種的檢測，對實驗結果進行分析。第三，未采用不同的微量稀釋法進行對比試驗，使得本研究的結果僅對比色微量稀釋法檢測。