增生型糖尿病視網膜病變患者眼玻璃體、增生膜組織LncRNA ANRIL表達及意義

陳日紅,楊依玲,王宏飛,吳榮輝

(浙江新安國際醫院眼科,浙江嘉興 314000)

糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy，DR)是一種眼部神經微血管病變，其主要是由糖尿病患者體內胰島素代謝異常進而損傷患者視功能[1]。增生型糖尿病視網膜病變(proliferative diabrtic retinopathy，PDR)是DR患者視網膜出現新生血管，可降低患者視力功能甚至造成失明。研究表明多種炎癥因子參與PDR發生及發展過程，但關于其具體發病機制尚未完全闡明[2]。現代生物技術發展迅猛，深入研究后發現長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，LncRNA)可在機體內多種生物學過程中發揮重要調控作用。研究顯示部分LncRNA可參與機體視網膜組織發育及晶狀體老化等過程[3]。長鏈非編碼RNA ANRIL(long non-coding RNA ANRIL，LncRNA ANRIL)是位于細胞周期激酶抑制因子4基因座中的非編碼長鏈RNA分子。研究表明，慢性心力衰竭患者血清LncRNA ANRIL表達水平明顯升高且與患者心功能嚴重程度有關，并可參與心血管生成等生物學過程[4]。體外培養高糖誘導細胞研究結果發現LncRNA ANRIL表達水平升高并可調控血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)表達進而參與調節糖尿病視網膜病變過程[5]。關于LncRNA ANRIL與VEGF在PDR患者中表達變化的相關研究相對較少，因此本研究主要探討PDR患者玻璃體及增生膜組織中LncRNA ANRIL與VEGF表達變化，以期為臨床治療方案的制訂提供參考。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2017年6月至2018年6月于本院進行玻璃體切割術的58例PDR患者為PDR組，且均為單側發病，其中男26例，女32例，年齡43～70歲，平均(55.67±7.87)歲，糖尿病病程為5～15年，平均(12.34±4.31)年，根據相關標準PDR患者Ⅴ期33眼、Ⅵ期25眼[6]。同時選取同期于本院進行玻璃體切割術的35例特發性黃斑裂孔患者為對照組，所有患者均為單側發病，其中男18例，女17例，年齡41～71歲，平均(54.26±8.21)歲。本研究經本院倫理委員會審核通過，所有患者知情且簽署同意書。納入標準：所有PDR患者均由2型糖尿病引發；出現玻璃體積血且藥物治療效果不佳；經B超檢查顯示視網膜前機化膜形成；未出現玻璃體積血但B超檢查顯示眼底出現牽拉性視網膜脫離；未接受抗新生血管藥物治療。排除標準：空腹血糖大于8 mmol/L；合并高血壓等其他慢性疾病；既往眼部手術史；其他原因導致的視網膜增生等視網膜血管性疾病；合并其他眼部疾病；合并惡性腫瘤、急慢性感染及免疫系統性疾病。兩組患者臨床資料比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2方法

1.2.1樣本采集 所有患者均接受玻璃體切割術，灌注前采用玻璃體切割頭分別抽取0.6 mL玻璃體，分別置于離心管中，置于-20 ℃冰箱內保存待測。術中分別留取PDR組患者視網膜前增生膜與對照組內界膜組織，置于-80 ℃超低溫冰箱保存待測。

1.2.2實時定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)檢測LncRNA ANRIL、VEGF mRNA表達水平 取凍存玻璃體或膜組織，研磨后加入細胞裂解液進行裂解，采用Trizol法(北京天根生化科技有限公司)提取玻璃體或膜組織總RNA，采用紫外分光光度計檢測總RNA純度(A260/A280≥1.80)。根據反轉錄試劑盒(上海玉博生物科技有限公司)將RNA反轉錄為cDNA。采用SYBR Green qPCR Master Mix(2X)試劑盒(美國Thermo Fisher Scientific公司)進行qRT-PCR反應。LncRNA ANRIL正向引物序列為5′-GCG CCG GAC TAG GAC TAT TT -3′，反向引物序列為5′-GCC AGG ACG GAG ATC AGA TG-3′；VEGF正向引物序列為5′-AAA CTG TCA GCT CGG TCA GA-3′，反向引物序列為5′-TCA GGG GCC GAT TAA AGC TC-3′；β-actin正向引物序列為5′-CAG CCA TGT ACG TTG CTA TCC AGG-3′，反向引物序列為5′-AGG TCC AGA CGC AGG ATG GCA TG-3′，引物均由上海生物工程股份有限公司合成。qRT-PCR反應體系20 μL：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(2×)混合液10 μL，cDNA 1 μL，上下游引物各0.4 μL，ddH2O 8.2 μL。qRT-PCR反應條件：95 ℃ 10 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共42個循環。采用2-ΔΔCt相對定量法計算LncRNA ANRIL、VEGF mRNA的相對表達量。7500型ABI實時熒光定量PCR儀購自上海興曼生物科技有限公司；紫外分光光度計購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司。

1.2.3Western blot檢測增生膜組織中VEGF蛋白表達 RIPA蛋白裂解液(長沙達爾鋒生物科技有限公司)裂解增生膜組織并提取總蛋白，12 000 r/min轉速離心15 min，吸取上清液移至另一EP管內，BCA檢測蛋白濃度，置于-20 ℃冰箱保存。取30 μg蛋白樣品上樣進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，結束后轉移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)，使用脫脂奶(5%)封閉2 h，加入稀釋比為1∶1 000的兔抗人VEGF抗體(上海浩然生物技術有限公司)，置于4 ℃冰箱保存過夜，次日采用PBST清洗后，加入稀釋比為1∶2 000的辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗體(武漢艾美捷科技有限公司)，室溫孵育30 min，使用ECL化學發光劑(上海生物工程股份有限公司)進行顯影反應，置于Bio-Rad GelDoc EZ凝膠成像系統(美國Bio-Rad公司)觀察蛋白條帶，采用IPP6.0軟件分析蛋白相對表達水平，蛋白相對表達水平=目的蛋白帶A值/內參照條帶A值。

1.3觀察指標 采集兩組患者入組時空腹靜脈血5 mL放入抗凝試管中放置2 h，1 500 r/min轉速離心20 min，吸取血清，應用全自動生化分析儀(美國貝克曼公司)檢測兩組患者空腹血糖(fasting plasmaglucose，FPG)、糖化血紅蛋白(glycosylated hemoglobin-A1c，HbA1c)水平。采用酶聯免疫吸附法(enzyme-linked immune sorbent assay，ELISA)檢測血清腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factors-α，TNF-α)、白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、白細胞介素-17(interleukin-17，IL-17)水平，檢測試劑盒均購自北京方程生物科技有限公司。采用免疫透射比濁法檢測C反應蛋白(C-reactive protein，CRP)水平，檢測試劑盒購自上海康朗生物科技有限公司。

2 結 果

2.1兩組患者臨床資料及血清指標比較 PDR組HbA1c、FPG、TNF-α、IL-6、CRP、IL-17水平均顯著高于對照組(P=0.001)，見表1。

表1 兩組患者臨床資料及血清指標比較

2.2兩組患者玻璃體中LncRNA ANRIL、VEGF mRNA表達水平 PDR組患者玻璃體中LncRNA ANRIL與VEGF mRNA表達水平均顯著高于對照組(P<0.05)，見表2。

表2 兩組患者玻璃體中LncRNA ANRIL、VEGF mRNA表達水平

2.3PDR患者玻璃體中LncRNA ANRIL與VEGF的相關性分析 Pearson法分析PDR患者玻璃體中LncRNA ANRIL與VEGF的相關性，結果顯示LncRNA ANRIL與VEGF呈正相關(r=0.599，P=0.001)，見圖1。

圖1 PDR患者玻璃體中LncRNA ANRIL與VEGF的關系

2.4兩組患者增生膜組織中LncRNA ANRIL與VEGF mRNA及蛋白表達水平比較 PDR組患者增生膜組織中LncRNA ANRIL與VEGF mRNA及蛋白表達水平均顯著高于對照組(P=0.001)，見表3、圖2。

表3 兩組患者增生膜組織中LncRNA ANRIL、VEGF mRNA及VEGF蛋白表達水平比較

圖2 兩組患者增生膜組織中VEGF蛋白表達

2.5PDR患者增生膜組織中LncRNA ANRIL與VEGF的相關性分析 Pearson法分析PDR患者增生膜組織中LncRNA ANRIL與VEGF的相關性，結果顯示LncRNA ANRIL與VEGF呈正相關(r=0.764，P=0.001)，見圖3。

2.6Logistic多因素分析影響PDR發生的相關因素 將影響PDR發生的相關因素進行Logistic多因素分析，結果顯示LncRNA ANRIL、VEGF均為PDR發生的影響因素，見表4。

表4 影響PDR發生因素的Logistic多因素分析

續表4 影響PDR發生因素的Logistic多因素分析

圖3 PDR患者增生膜組織中LncRNA ANRIL與VEGF的關系

3 討 論

PDR發生與患者體內炎性反應、二酰甘油-蛋白激酶C系統活化及自由基生成等病理過程密切相關，研究表明DR患者血清VEGF水平明顯升高并可反映疾病嚴重程度[7-8]。相關研究表明，LncRNA MIAT可通過調控mi-150-5p及其靶基因VEGF表達進而對視網膜血管內皮細胞功能發揮調節功能[9]。目前關于LncRNA與PDR發病機制的研究相對較少，因此本研究初步分析了LncRNA ANRIL與PDR發生過程的關系，為臨床治療提供新靶點。

LncRNA ANRIL位于人染色體9p21并冠狀動脈粥樣硬化性心臟病易感性有關[10]。研究表明LncRNA ANRIL是細胞周期激酶抑制因子4基因位點的反義長鏈非編碼RNA，其基因多態性可影響β細胞增殖能力并降低其細胞數量代償性，進而參與糖尿病發生過程[11]。近來研究顯示，糖尿病合并腦梗死患者中LncRNA ANRIL還可通過上調VEGF表達并激活轉錄因子-核因子(NF-κB)信號通路，進而促進血管生成[12]。同時相關研究指出，高糖誘導的視網膜內皮細胞中LncRNA ANRIL表達水平明顯升高并降低微小RNA-200b(miR-200b)表達，緩解miR-200b對其靶基因VEGF的抑制作用，進而促進視網膜病變的發生[13-14]。因此，推測LncRNA ANRIL可能通過間接調控VEGF表達進而參與PDR發生過程。本研究結果顯示，PDR組患者玻璃體及視網膜前增生膜組織中LncRNA ANRIL與VEGF相對表達水平均明顯高于對照組，說明PDR患者玻璃體及視網膜前增生膜組織中LncRNA ANRIL與VEGF表達升高，并與PDR發生過程有關。提示LncRNA ANRIL表達水平升高可促進PDR發生。

DR患者血清TNF-α、IL-6、CRP、IL-17等炎癥因子水平升高并可作為臨床診斷DR的重要標記物，其中TNF-α可激活Rho激酶并損傷糖尿病患者微血管，進而引發DR，血清IL-6及CRP水平升高均可引發糖尿病患者出現微血管病變[15-16]。本研究結果中PDR組HbA1c、FPG、TNF-α、IL-6、CRP、IL-17水平均顯著高于對照組，說明PDR患者體內炎性反應加重并可能出現不同程度的血管病變。研究表明VEGF可通過與其受體結合改變血管通透性進而參與DR發生過程促進血管形成[17]。因此，本研究主要研究PDR患者玻璃體及增生膜組織中LncRNA ANRIL與VEGF表達水平的相關性，結果顯示PDR患者玻璃體及增生膜組織中LncRNA ANRIL與VEGF均呈正相關，說明LncRNA ANRIL可與VEGF相互作用，進而參與PDR發生過程。分析原因可能為PDR患者玻璃體及增生膜組織中LncRNA ANRIL表達水平升高可能通過降低miR-200b表達進而緩解其對VEGF的抑制作用并促使VEGF表達水平升高，高表達的LncRNA ANRIL與VEGF可參與機體炎性反應及血管生成過程，進而促進PDR發生。同時本研究Logistic多因素分析顯示LncRNA ANRIL、VEGF表達水平均為PDR發生的影響因素，提示LncRNA ANRIL表達水平升高可增加PDR發生風險。

綜上所述，LncRNA ANRIL在LPDR患者玻璃體及增生膜組織中呈高表達，并可能通過調控VEGF表達，進而參與PDR發生過程，為揭示PDR發生機制作鋪墊，為臨床治療提供新思路。本研究存在不足之處，關于LncRNA ANRIL在PDR發生及發展過程中的具體作用機制有待進一步研究。