探討鞘內注射siRNA-P300通過cAMP-PKA-CREB通路對神經病理性痛大鼠鎮痛效果的影響*

劉志軍,姜云峰,胡兵偉

(浙江省立同德醫院麻醉科，杭州 310012)

脊髓損傷是一種在醫療實踐中觀察到的極其嚴重的身體創傷，影響著全世界200多萬人的生活質量。脊髓損傷患者最常見的癥狀是慢性神經性疼痛。因此，開發有效的治療藥物對于脊髓損傷患者具有臨床重要性[1-3]。研究發現脊髓損傷通過環磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)-蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)-反應元件結合蛋白(cAMP response element-binding protein，CREB)通路導致背角神經元和損傷部位的突觸電路發生明顯變化，進而導致神經細胞受體的表達異常，局部炎性細胞因子和活性氧物質的釋放，小膠質細胞和其他免疫細胞中免疫應答激活[4-5]。PKA是G蛋白偶聯受體的家族成員，研究表明脊柱L4～L6水平約60%的背根神經節神經元含有PKA。通過外周或中樞施用非炎性劑量的PKA激動劑刺激PKA可引起大鼠的機械痛覺和熱痛覺過敏。研究進一步表明，P物質和降鈣素基因相關肽(CGRP)的釋放通過激活PKA促成急性和慢性疼痛[6-7]。在具有神經性疼痛的實驗動物模型中，PKA的表達在誘導疼痛后的脊髓背角中上調，并且阻斷脊髓背角PKA消除了在動物中觀察到的機械痛覺和熱痛覺過敏。P300是高等真核生物中作用廣泛的輔助激活因子，也是一類組蛋白乙酰轉移酶，近期研究發現，P300能夠抑制疼痛相關基因及其上下游轉錄因子的表達，其可能是神經病理性痛的關鍵治療點[8-9]。本研究擬基于cAMP-PKA-CREB通路探討P300小干擾RNA(siRNA-P300)鞘內注射對神經病理性痛大鼠鎮痛效果的影響，為脊髓損傷引起的神經病理性痛的治療提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1動物分組及染毒 成年Sprague-Dawley大鼠(體質量180～200 g)60只由南京醫科大學實驗動物中心提供[合格證號：SCXK(蘇)2014-0002]。在無特定病原體(SPF)、溫度(22±2)℃、濕度40%～70%、2 h光照/黑暗循環(上午8:00光照)的軟墊層條件下飼養，每籠5只，大鼠自由攝取飼料、自由飲水。實驗進行前，動物適應喂養2 h。將大鼠分成3組：對照組、模型組、siRNA-P300組，每組20只，雌雄各半。實驗嚴格按照《中華人民共和國實驗動物管理條例》和《實驗動物質量管理方法》進行，動物實驗獲得本院動物研究委員會的批準。

1.2各實驗組的制備 模型組、siRNA-P300組大鼠制備坐骨神經慢性壓迫性損傷(CCI)模型。具體操作如下：大鼠禁食、禁水12 h，水合氯醛(300 mg/kg，腹膜內)誘導麻醉。將每只大鼠左側大腿中部的坐骨神經暴露，在坐骨神經三叉神經的近端，將大約7 mm的神經與黏附的組織分離，用4根結扎線松散地系在它周圍，結扎之間距離約1 mm。手術后，縫合皮膚層和肌肉，手術區域用碘消毒。對照組僅暴露坐骨神經，不予結扎，并縫合皮膚層和肌肉。siRNA-P300組于造模成功后第1天開始給予siRNA-9300鞘內注射(注射劑量1.0 mL/100 g)，具體操作流程為：在麻醉下，在L5和L6椎骨之間插入26 G規格的針頭，注射約10 μL含有siRNA-P300混合物(0.2 μg/μL，美國Santa Cruz Biotechnology公司)的工作溶液，持續給藥3周，對照組和模型組鞘內注射等體積生理鹽水。實驗結束后，每5分鐘觀察大鼠疼痛行為學1次，并計算疼痛加權評分(PIS)：大鼠舔咬注射足或抽動為Ⅳ級；足抬起，不接觸玻璃缸面為Ⅲ級；足掌輕微接觸玻璃缸面，活動時有跛行為Ⅱ級；PIS=(TⅡ+2×TⅢ+3×TⅣ)/300，其中TⅡ、TⅢ、TⅣ分別為5 min內出現Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ級行為的時間(s)。

1.3腰椎脊髓病理切片制作 腰椎脊髓組織常規脫水、包埋、切片，于二甲苯(Ⅰ) 15 min、二甲苯(Ⅱ) 15 min、二甲苯∶無水乙醇=1∶1 2 min、100%乙醇(Ⅰ) 5 min、100%乙醇(Ⅱ) 5 min、80%乙醇 5min、蒸餾水 5 min、蘇木精液染色5 min、水洗10 min或流水沖洗5 min、1%鹽酸乙醇30 s、水洗30 s、蒸餾水過洗5 s、0.5%伊紅液染色1～3 min、蒸餾水稍洗30 s、80%乙醇稍洗30 s、95%乙醇(Ⅰ)1 min、95%乙醇(Ⅱ) 1 min、無水乙醇 (Ⅰ)3 min、無水乙醇(Ⅱ)3 min、二甲苯(Ⅰ) 3 min二甲苯(Ⅱ) 3 min、中性樹膠封固。

1.4機械痛閾值、熱痛閾的測定 各組大鼠處死前，根據文獻[9]方法測定機械痛閾值、熱痛閾。具體操作：美國Ⅱ TC公司生產的2390 series 電子 von Frey 壓力測痛儀觸壓大鼠左足第3、4趾間的皮膚，當大鼠出現后足抬起、迅速回縮反應時讀取數值作為熱痛閾；熱輻射刺激儀照射大鼠右側足底緊貼玻璃板部位，記錄抬足時間為機械痛閾值，截止時間為25 s。

1.5cAMP、PKA、CREB mRNA在脊髓組織中表達的測定 通過使用TRIzol試劑(美國Life Technologies公司)從同側脊髓分離總RNA，并使用Oligo(dT)18引物將其反轉錄成cDNA。使用Applied Biosystems7300實時PCR系統(美國Applied Biosystems公司)進行實時定量PCR(qPCR)。qPCR引物如下，cAMP:正向5′-TCT TTC CTA CAA CAG CCT CCG-3′，反向5′-TAA ATG CTC GCT TCA AAC TCA G-3′；PKA：正向5′-TCG AAG GCG ACC TCA AGT G-3′,反向5′-TTC GGT GTA GCT TTG GAT CCA-3′;CREB：正向5′-ACC GTC GCC CAT CAT CAA-3′，反向5′-TTG CAC TGC CAA CTC TTT GTC T-3′;GAPDH：正向5′-ATG ACT CTA CCC ACG GCA AG-3′,反向5′-CTG GAA GAT GGT GAT GGG TT-3′；其中GAPDH用作內參。qPCR反應條件：94 ℃預變性10 min；94 ℃ 10 s，55 ℃ 10 s,72 ℃ 10 s,40個循環。使用閾值循環(Ct)方法分析數據，并將結果表示為倍數差異。實驗重復3次。

1.6cAMP、PKA、CREB在脊髓組織中表達的測定 通過腹腔注射水合氯醛(300 mg/kg)深度麻醉后，用生理鹽水經心臟灌注動物，然后用0.1%磷酸鹽緩沖液(PBS)配制的pH為7.4的4%多聚甲醛灌注20 min。于L4和腰椎將脊髓片段解剖出來并在4%多聚甲醛中固定，然后切成25 μm厚。將每組的切片與山羊抗體鼠cAMP(1∶200)、PKA(1∶100)、CREB(1∶100)一抗一起孵育。然后，用PBS洗滌切片并與二抗孵育。用PBS洗滌3次后，在免疫熒光顯微鏡(Zeiss AX10，徳國)下研究樣品的免疫熒光染色的形態學細節。雙盲進行檢查。隨機編碼圖像，并通過Image Pro Plus 6.0軟件(美國Media Cybernetics Inc.Rockville公司)分析。染色評分標準：0表示小于5%陽性染色細胞(陰性染色)；1+表示5%～20%陽性染色細胞(弱表達)，2+表示21%～50%陽性染色細胞(中表達)，3+表示大于50%陽性染色細胞(強表達)。染色強度評分為0～3(0，陰性;1，弱;2，中等;3，強)。然后將數量和染色強度評分的值相乘，得到范圍為0～9的結果。

1.7ELISA測定大鼠脊髓組織中cAMP、PKA、CREB、白細胞介素(IL)-2、IL-6、腫瘤壞死因子α(TNF-α)水平 無菌條件下，稱取0.1 g脊髓組織，加入少量液氮，在研缽中迅速將海馬組織碾碎至粉末狀；將組織粉末轉入2 mL Eppendorf管中，加入1.2 mL PBS(pH為7.4)，充分振蕩混勻，2 000×g、4 ℃離心20 min，收集上清液。大鼠cAMP、PKA、CREB、IL-2、IL-6、TNF-α ELISA試劑盒購自美國R&D Systems公司。使用酶標儀(Model 550，美國Bio-Rad公司)在450、512、539、429、529、487 nm波長下讀取吸光度(A)值。實驗重復3次。

2 結 果

2.1各組大鼠機械痛閾值、熱痛閾、PIS的比較 與對照組比較，模型組、siRNA-P300組機械痛閾值、熱痛閾降低，PIS升高(P<0.05)；與模型組比較，siRNA-P300機械痛閾值、熱痛閾升高，PIS降低(P<0.05)。見表1。

2.2各組大鼠脊髓組織病理形態學比較 對照組脊髓區神經元細胞完整，結構正常，染色清晰，細胞核呈卵圓形位于中央；模型組脊髓區可見大量壞死神經元，且細胞脫失現象明顯，細胞核固縮，可見中性細胞及少量嗜酸性細胞浸潤；siRNA-P300組脊髓區見少量壞死神經元，且神經元細胞結構較為完整，神經元細胞核呈卵圓形位于中央，分布均勻。見圖1。

表1 各組大鼠機械痛閾值、熱痛閾、PIS的比較

a：P<0.05,與對照組比較；b：P<0.05,與模型組比較

A:對照組 B:模型組 C：siRNA-P300組

圖1各組大鼠脊髓組織病理形態學觀察(蘇木素-伊紅×400)

2.3各組大鼠脊髓cAMP、PKA、CREB mRNA表達水平比較 與對照組比較，模型組、siRNA-P300組脊髓cAMP、PKA、CREB mRNA表達水平明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，siRNA-P300組脊髓cAMP、PKA、CREB mRNA表達水平明顯降低(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠脊髓cAMP、PKA、CREB mRNA表達水平比較

a：P<0.05,與對照組比較；b：P<0.05,與模型組比較

2.4各組大鼠脊髓cAMP、PKA、CREB表達評分比較 免疫組織化學法下，cAMP、PKA、CREB主要定位于細胞核，其陽性表達為棕褐色；與對照組比較，模型組、siRNA-P300組脊髓cAMP、PKA、CREB表達評分明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，siRNA-P300組脊髓cAMP、PKA、CREB表達評分明顯降低(P<0.05)。見表3、圖2。

2.5各組大鼠脊髓IL-2、IL-6、TNF-α表達水平比較 與對照組比較，模型組、siRNA-P300組脊髓IL-2、IL-6、TNF-α表達水平明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，siRNA-P300組IL-2、IL-6、TNF-α表達水平明顯降低(P<0.05)。見表4。

表3 各組大鼠脊髓cAMP、PKA、CREB表達評分比較分)

a：P<0.05,與對照組比較；b：P<0.05,與模型組比較

表4 各組大鼠脊髓IL-2、IL-6、TNF-α表達水平比較

a：P<0.05,與對照組比較；b：P<0.05,與模型組比較

圖2 各組大鼠脊髓部cAMP、PKA、CREB表達情況觀察(免疫組織化學×400)

3 討 論

脊髓損傷引起的神經性疼痛與感覺異常及改變的刺激-反應功能有關，例如異常性疼痛，痛覺過敏和某些區域的感覺喪失。國際疼痛研究協會將神經性病理痛定義為“由軀體感覺神經系統的病變或疾病引起的疼痛”。神經性疼痛對患者的生活質量造成沉重負擔，而目前可用的治療方法效果通常存在局限。神經性病理痛的潛在分子機制仍然很難闡明，越來越多的證據表明，P300基因可能與神經性病理痛發病機制密切相關。P300基因在組織內廣泛表達，其在各生物過程中發揮重要作用。P300通過橋接、支架或組蛋白乙酰轉移酶(HAT)活性調節各種基因的表達，其在表觀遺傳學上導致炎癥、腫瘤、神經退行性等疾病。siRNA可通過基因組中載體靶向沉默基因表達。鞘內應用siRNA已成為研究藥物、受體或其他基因、蛋白質等小分子功能的有效方法[10-12]。研究已證實siRNA-P300能專一性抑制脊髓的P300 mRNA表達，導致P300介導的組蛋白乙酰化作用減弱，進而抑制各類疼痛相關轉錄因子的轉錄，最終緩解疼痛。本研究結果表明，與對照組比較，模型組、siRNA-P300組機械痛閾值、熱痛閾降低，PIS升高；與模型組比較，siRNA-P300組機械痛閾值、熱痛閾升高，PIS降低。結合病理學結果說明，siRNA-P300鞘內注射對脊髓區神經元細胞具有保護作用，對大鼠神經病理性痛具有鎮痛效果。

PKA是G蛋白偶聯受體的家族成員，同時也是一種非選擇性陽離子通道。近期研究表明PKA可被多種內源性物理和化學刺激物激活，如高溫，低pH(酸性條件)，內源性大麻素和酰胺，N-油酰多巴胺和N-花生四烯酰-多巴胺等。PKA的激活導致痛苦的灼燒感[13-14]。PKA受體主要存在于外周神經系統的感受神經元中，但其也存在于包括腦和脊髓在內的中樞神經系統中。PKA參與疼痛的傳遞和調節，以及多種疼痛刺激的整合。有證據表明PKA具有調節外周和中樞神經系統神經性病理痛的作用[15-16]。近期研究表明，脊髓損傷大鼠淺表背角中PKA表達上調，PKA拮抗劑FSLLRY-NH2能減弱脊髓損傷誘發的機械痛覺和熱痛覺過敏。cAMP、CREB分別是PKA的上、下游調控因子，研究表明cAMP、CREB也是參與神經性病理痛的兩種重要神經遞質物質，其表達水平在脊髓損傷大鼠的淺表背角中顯著增加，在鞘內注射各自相應的抑制劑(SB366791、HC030031)后，大鼠機械痛閾值、熱痛閾升高[17-18]。本次研究結果顯示，與對照組比較，模型組、siRNA-P300組脊髓cAMP、PKA、CREB mRNA和蛋白表達水平明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，siRNA-P300組脊髓cAMP、PKA、CREB mRNA和蛋白表達水平明顯降低(P<0.05)。這與前述研究結果一致，同時也說明siRNA-P300可通過抑制cAMP-PKA-CREB通路的激活進而抑制神經病理性痛。近期研究發現，PKA在疼痛和神經源性炎癥中具有功能性作用，PKA通過CREB通道活化各種化合物，包括刺激性物質、活性氧和炎癥因子(IL-2、IL-6、TNF-α)等。本研究結果顯示，與對照組比較，模型組、siRNA-P300組脊髓IL-2、IL-6、TNF-α表達水平明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，siRNA-P300組IL-2、IL-6、TNF-α表達水平明顯降低(P<0.05)，這說明siRNA-P300抑制神經病理性痛與抑制cAMP-PKA-CREB通路的激活進而抑制炎癥因子IL-2、IL-6、TNF-α的表達有關。

綜上所述，siRNA-P300鞘內注射對脊髓區神經元具有保護作用，對大鼠神經病理性痛具有鎮痛效果；其機制與siRNA-P300抑制cAMP-PKA-CREB通路的激活進而抑制炎癥因子IL-2、IL-6、TNF-α的表達有關。