外源果膠甲酯酶和氯化鈣復合處理對樹莓采后品質的影響

閻然，楊曉穎，傅茂潤*，杜雅珉，孫斐，劉亞敏，王金玲，竇廣磊

1(齊魯工業大學(山東省科學院) 食品科學與工程學院，山東 濟南，250353) 2(西南大學 資源環境學院，重慶， 400716) 3(東北林業大學林學院，黑龍江 哈爾濱，150040) 4(章丘龍翔樹莓生物科技有限公司，濟南 章丘，250000)

樹莓為薔薇科懸鉤子屬植物，又名木莓、托盤、覆盆子等，果實柔軟多汁，酸甜可口，被FAO推薦為“生命之果”[1]。其含有豐富的鞣花酸、水楊酸、黃酮等酚類物質以及SOD(超氧化物歧化酶)，具有很高的抗氧化作用和藥用價值[2]。但是，樹莓果皮極薄，組織嬌嫩，結構易碎，且呼吸速率高，是一種極易腐敗的果品，在貯藏、運輸過程中易受機械損傷和微生物侵染，極易失去商品價值[3]。因此，樹莓貨架期的品質維持是亟待解決的問題。

Ca2+是植物生長發育過程中必不可少的礦物質元素之一。作為植物體內的第二信使，參與調節細胞內各類酶的活性與代謝。鈣使植物細胞細胞壁硬度增加，降低質膜透性[4]，調節呼吸代謝速率，抑制乙烯合成，延緩衰老，從而延長果實貨架期[5]。目前，在西蘭花[6]、蘋果[7]、甜瓜[8]、彩椒[9]等蔬菜和水果已有大量報道。果膠甲酯酶可以降低高酯果膠的酯化度(將高甲氧基果膠轉化為低甲氧基果膠)，從而形成果膠酸，而果膠酸和外源添加的Ca2+在原位形成堅固、不可逆的果膠酸鈣網絡結構，防止果膠物質溶出，提高果蔬品質[10]。李曉等[10]研究外源果膠甲酯酶(exogenous pectin methylesterase,ePME)對腌漬黃瓜質構特性的影響，表明外源果膠甲酯酶可提高腌漬黃瓜的硬度、咀嚼度。ANTHON等[11]研究發現果膠甲酯酶可以有效提高白蘿卜泡菜的脆度。然而，果膠甲酯酶在采后樹莓保鮮方面應用尚未報道。本實驗主要研究外源添加果膠甲酯酶對樹莓貯藏品質的影響，以期為樹莓保鮮提供新的技術。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅樹莓(品種為R20)：2018年10月16日采自章丘市龍山莓園；果膠甲酯酶： DSM有限公司(Rapidase?PEP)；乙醇：天津市富宇精細化工有限公司; DPPH：阿拉丁試劑上海有限公司;NaOH：國藥集團化學試劑有限公司;蒽酮、FeCl3、鐵氰化鉀：天津市科密歐化學試劑有限公司,以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

YP20002電子天平，金諾天平儀器有限公司；V-1100D分光光度計，上海美歐達公司；SK3200HP超聲波清洗器，上海科導超聲儀器有限公司；DK-98-Ⅱ水浴鍋，天津市泰斯特儀器有限公司；TGL16冷凍離心機，長沙英泰儀器有限公司；FLF-YS-828L型恒溫保鮮柜，北京福意電器有限公司；SHIMADZU高效液相色譜儀(HPLC)LC-20A，日本島津公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 前處理方法

選取無病蟲害、無機械傷且成熟度一致的樹莓，隨機分為3組，分別是對照組(無任何保鮮劑)、氯化鈣處理組(CaCl2)、果膠甲酯酶與氯化鈣復配處理組(CaCl2+ePME)。其中，對照組：用清水浸泡樹莓1 min，于室溫自然晾干；CaCl2處理組：稱取2 g的CaCl2溶于1 000 mL蒸餾水中，配置成質量濃度為0.2 g/L CaCl2溶液浸泡樹莓1 min，于室溫自然晾干；CaCl2+ePME處理組：吸取0.5 mL果膠甲酯酶溶液，以及稱取2 g的CaCl2，共同溶于1 000 mL蒸餾水中，用檸檬酸緩沖溶液調pH值至4.5, 在40 ℃條件下保溫20 min。將樹莓果實浸泡1 min,取出后自然晾干。將所有樣品置于塑料托盤內，放在保鮮柜(溫度(4±1)℃，濕度(90±5)%)中貯藏，每隔3 d取樣，觀察并測定相關指標。

1.3.2 指標測定

1.3.2.1 有機酸的提取和測定

參照陳明[12]的方法，略有改動。稱取2 g的果實樣品在液氮中研磨并溶解于5 mL、 80%(體積分數)乙醇中，在35 ℃的條件下放置后，以10 000 r/min轉速離心10 min后收集上清液并用80%乙醇稀釋到25 mL，提取2 mL的溶液在45 ℃條件下旋轉蒸干后將剩余物溶解在1 mL的蒸餾水中，用0.45 μm微孔濾膜過濾后備用。將20 μL的樣品注入ODS-C18柱進行液相分析，SPD-20A檢測器，檢測波長210 nm。以流速為0.8 mL/min, 50 mmol/L的(NH4)2HPO4作為流動相，并用H3PO4將pH值調整至2.7。結果用mg/g新鮮果實表示。

1.3.2.2 糖組分的提取和測定

參照OLSEN等[13]的方法，有少量改動。稱取1.5 g樣品在液氮中磨成粉末并溶解于40 mL 80%乙醇中。超聲提取30 min后過濾。上清液在50 ℃ 條件下旋轉蒸干后將剩余物溶解于10 mLV(乙晴)∶V(水)=70∶30中，用0.45 μm微孔濾膜過濾后備用。色譜柱為NH2柱(5 μm，250 mm×4.6 mm)，柱溫30 ℃，以RID-10A為檢測器進行液相分析。流動相為V(乙晴)∶V(水)=80∶20中，流速為0.7 mL/min，進樣量20 μL。外標法，結果用mg/g新鮮果實表示。

1.3.2.3 品質指標測定

可溶性糖測定采用蒽酮比色法[14]。總酸參考GB/T 12456—2008(食品中總酸的測定)進行測定，略有改動。Vc測定參照馬宏飛等[15]紫外分光光度法，略有改動，標準曲線為y=0.058x+0.003，R2=0.999 3。

1.3.2.4 黃酮、抗氧化活性測定

黃酮參照曹建康等[16]的方法測定。黃酮物質以每克果實在波長325 nm處吸光值(OD325)表示。抗氧化活性：還原力采用MAO等[17]的方法，略有改動，在700 nm下測定吸光值；DPPH自由基清除能力測定采用BRAND-WILLIAMS等[18]的方法，在波長為517 nm處測得吸光值。

1.4 數據處理

用Excel 2010軟件繪制圖表，并用SPSS 21.0統計軟件進行差異顯著性分析，P<0.05表示差異顯著；P<0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 樣品分析

2.1.1 樹莓果實中有機酸的保留時間及峰型確定

由有機酸的混合標準樣和樣品的色譜出峰情況來看，總體分離情況較好。標準樣品中草酸和D-酒石酸距離較近。樣品中D-酒石酸峰型尖銳，而草酸峰型較差，保留時間偏移較大(圖1)。

A-標準樣品；B-樹莓樣品圖1 有機酸混合標準樣和樹莓樣品的高效液相色譜出峰圖Fig.1 HPLC chromatograms of organic acid standards,organic acid extracted from red raspberries注：1-草酸(3.281 min)；2-D-酒石酸(3.544 min)；3-L-蘋果酸(4.138 min)；4-檸檬酸(5.250min)；5-琥珀酸(6.800 min)。

2.1.2 樹莓果實中糖組分保留時間及峰型確定

由糖的混合標準樣和樣品的色譜出峰情況來看，果糖、葡萄糖、蔗糖峰型尖銳，高效液相色譜法達到很好的分離效果(圖2)。

A-標準樣品；B-混合樣品圖2 糖組分混合標準樣和樹莓樣品的高效液相色譜出峰圖Fig.2 HPLC chromatograms of sugars standards,sugars extracted from red raspberries注：1-果糖(8.077 min)；2-葡萄糖(8.746 min)；3-蔗糖(11.185 min)。

2.2 樹莓果實有機酸代謝

有機酸是一類天然化合物，在果實生長發育階段不斷積累，在果實成熟階段被當作呼吸底物不斷消耗[19]，形成特定的糖酸比。從圖3中可以看出，樹莓中主要的有機酸是檸檬酸，其次是L-蘋果酸，而D-酒石酸和琥珀酸的含量相對較少。

CaCl2單獨處理以及與外源果膠甲酯酶復合對不同種類的有機酸影響是有區別的。如圖3-A所示，對照組中D-酒石酸呈現先下降后上升的變化趨勢，而CaCl2+ePME和CaCl2處理組中D-酒石酸均呈現“波動狀”，在第3天出現最小值，分別為1.65和1.68 mg/g。貯藏至第6天，對照與各處理組之間開始出現顯著性差異(P<0.05)，這說明CaCl2單獨處理和復合處理均能延緩樹莓果實中D-酒石酸的降解，保持果實酸度。圖3-B中，貯藏至12 d時，CaCl2+ePME處理組L-蘋果酸顯著高于對照組(P<0.05)，而與CaCl2處理組之間無差異(P>0.05)。這說明相比于對照組和CaCl2處理組，復合處理更有利于保持果實中L-蘋果酸的含量。圖3-C中，對照組和CaCl2+ePME處理組中檸檬酸含量在貯藏過程中變化較小，分別為5.18和3.78 mg/g，而CaCl2處理組中檸檬酸含量的極差高達7.01 mg/g。圖3-D所示，對照組以及各處理組中琥珀酸含量變化均呈“波動狀”。貯藏至第12天，CaCl2+ePME處理中琥珀酸是對照組的1.25倍，達到極顯著水平(P<0.01)，這說明CaCl2+ePME處理可以延緩果實中琥珀酸的減少。因此，在果實貯藏后期，各處理組均可以減緩各種有機酸的降低，保持果實的口感和品質，延長貨架期。結合表1中總酸的變化趨勢，可以得知總酸與有機酸的變化呈一定的相關性，在貯藏后期，果膠甲酯酶和CaCl2復合處理對酸度調節作用更明顯。

A-D-酒石酸；B-L-蘋果酸；C-檸檬酸；D-琥珀酸圖3 CaCl2單獨以及與果膠甲酯酶復合處理對樹莓中有機酸的影響Fig.3 Effect of CaCl2 alone and combined with exogenous pectin methylesterase on organic acid of raspberry fruit注：不同的大寫字母表示組內存在顯著性差異(P<0.05);不同的小寫字母表示組間存在顯著性差異(P<0.05)。下同。

2.3 樹莓果實糖組分代謝

果實中的糖分主要來源于植物光合作用，而果實采后由于缺少光合器官的供給，糖分作為呼吸底物進行消耗。果實會優先利用糖類維持呼吸作用，其次是有機酸，蛋白質和脂肪較少[20]。樹莓中以果糖、葡萄糖和蔗糖為主。由圖4可以看出，在貯藏3～9 d時，CaCl2處理可以顯著保持果實中的果糖和葡萄糖(P<0.05)，而對于蔗糖影響較小。這說明樹莓果實首先利用單糖作為呼吸底物，其次是多糖。CaCl2處理有效減緩了果實中果糖和葡萄糖的消耗，有利于糖分的積累，調節呼吸代謝，進而保持果實的口感和品質。

A-果糖；B-葡糖糖；C-蔗糖圖4 CaCl2單獨以及與果膠甲酯酶復合處理對樹莓中糖組分的影響Fig.4 Effect of CaCl2 alone and combined with exogenous pectin methylesterase on carbohydrate composition of raspberry fruit

2.4 可溶性糖和總酸、Vc含量

可溶性糖是評價果實風味的重要指標之一，樹莓中的可溶性糖在貯藏中后期出現回升，可能由于果實在成熟過程中，將部分有機酸轉化成糖，使糖的含量有小幅增加。CaCl2+ePME和CaCl2處理的樹莓中可溶性糖在整個貯藏期間極差分別為1.45%和1.34%，這說明CaCl2處理有利于維持果實中可溶性糖的穩定。

各處理組中，樹莓果實的總酸含量整體呈下降趨勢，且在貯藏后期(9 d和12 d)降幅較大，這是由于果實自身呼吸代謝消耗。貯藏至12 d時，對照組比新鮮果實減少了37%，CaCl2和CaCl2+ePME處理分別減少了30%和17%，差異達到顯著水平(P<0.05)，這說明CaCl2以及與果膠甲酯酶復合處理均可以延緩果實中總酸的下降，且復合處理效果更好。隨著貯藏時間不斷延長，對照組Vc含量呈整體下降趨勢，而CaCl2與CaCl2+ePME處理組在12 d均出現顯著上升趨勢(P<0.05)，分別是對照的1.34倍和1.67倍。這表示在貯藏后期處理組均能延緩樹莓果實中Vc含量的下降，有利于保持果實品質，延長貨架期，且復合處理組保鮮效果好于其他處理組(表1)。

表1 氯化鈣單獨及與果膠甲酯酶復合處理對樹莓可溶性糖、總酸和Vc含量的影響Table 1 Effect of CaCl2 alone or combined with exogenous pectin methylesterase on soluble sugar,total acid and Vc content of raspberry fruit

注：組內相同字母代表無顯著差異(P>0.05),組內不同字母代表有顯著差異(P<0.05)。

2.5 黃酮、還原力和DPPH自由基清除能力

由圖5-A和圖5-B可知，隨著貯藏時間的延長，各處理組中樹莓的還原力和DPPH自由基清除能力總體呈上升趨勢。貯藏至第6天時，CaCl2+ePME和CaCl2處理樹莓中的還原力和DPPH自由基清除能力均顯著高于對照組(P<0.05)，這說明二者均可提高樹莓的抗氧化能力。貯藏至第9天時，CaCl2處理組中樹莓的還原力和DPPH自由基清除能力顯著高于CaCl2+ePME處理組(P<0.05)，這表明CaCl2處理更能有效提高果實中抗氧化能力，延緩果實衰老。

與之類似的，由圖5-C可以看出，對照組和處理組的樹莓在貯藏期間黃酮含量總體呈上升趨勢。在貯藏第9天，CaCl2處理組中樹莓黃酮含量明顯高于CaCl2+ePME和對照(P<0.05)，分別是復合處理的1.23倍，對照的1.21倍，這說明與其他處理組和對照組相比，CaCl2單獨處理更能有效延緩果實中黃酮的降解。

A-還原力；B-DPPH自由基清除能力；C-黃酮圖5 CaCl2單獨以及與果膠甲酯酶復合處理對樹莓抗氧化能力的影響Fig.5 Effect of CaCl2 alone and combined with exogenous pectin methylesterase on antioxidant ability of raspberry fruit

3 討論

有機酸是形成樹莓果實口感和品質的獨特組分。樹莓中檸檬酸含量高于其他有機酸，因此是檸檬酸優勢型果實。這與CEKIC等[21]、曠慧等[22]報道結果一致。檸檬酸產生酸感快，但持續性差；而蘋果酸產生酸感爽口且較慢，持續性較好。曠慧等[22]研究6種樹莓果實中均不含酒石酸，與本實驗研究結果存在差異，可能是由于樹莓的本身品種以及實驗的分離條件存在差異。果實中糖組分主要有葡萄糖、果糖和蔗糖。LIU等[23]使用茉莉酸甲酯對櫻桃番茄進行采后處理，其葡萄糖和蔗糖顯著高于對照，而果糖以及總糖含量沒有變化。這與HUANG等[24]研究茉莉酸甲酯對貯藏期間藍莓糖組分的變化結果一致。而本實驗通過外源果膠甲酯酶和CaCl2處理，樹莓果實中葡萄糖和果糖顯著提高，但蔗糖影響較小。這可能與果實的種類以及保鮮處理方式有關。酚類物質、DPPH與果實抗氧化能力有關。本實驗中添加Ca2+能有效提高果實中黃酮含量、還原力以及DPPH自由基清除能力。這與武繼蕓[25]研究的結果一致，這與Ca2+有效調節果實的次生代謝有關。

果膠甲酯酶(pectin methylesterase，PME)對果實的質構特性(硬度、脆度、咀嚼度)有重要的影響。謝瑋等[26]研究不同采收季蓮藕中果膠甲酯酶對質構的影響時發現，蓮藕硬度與果膠甲酯酶活性呈正相關，而與酯化度呈負相關關系。杜小琴等[27]研究表明，經過果膠甲酯酶處理泡菜的酯化度明顯降低，脆度提高。宗迪等[28]研究表明，果膠甲酯酶處理有效提高蘋果切塊的硬度保持率(48.5%)高于未處理蘋果切塊(32.5%)。因此，外源果膠甲酯酶處理對樹莓質構特性的影響有待于進一步研究。

YANG等[29]研究在真空條件下，乳酸鈣和PME處理鮮切木瓜的硬度和咀嚼度分別是未處理木瓜的8.02和7.83倍。這與ZHANG等[30]研究結果相同。在真空條件下，冬棗經過果膠甲酯酶與CaCl2的復合處理，果實品質有明顯改善。這主要是由于真空作用促進果膠甲酯酶和Ca2+的充分滲透。而本實驗中果膠甲酯酶處理效果不明顯，可能是由于浸泡時間較短，外源果膠甲酯酶以及Ca2+未能深入至果實組織內部，今后可采用真空、超聲輔助等措施，以到達更好的保鮮效果。

4 結論

樹莓果實的口感和品質由糖和有機酸的種類和含量決定。在貯藏前期，CaCl2單獨處理可以保持果實中較高的葡萄糖和果糖，維持可溶性糖的穩定，有利于糖分的積累，但對于蔗糖沒有任何影響；而貯藏后期，果膠甲酯酶和CaCl2復合處理更有利于延緩果實中各種酒石酸、蘋果酸、檸檬酸、琥珀酸的降解，維持果實中總酸的含量。果膠甲酯酶、CaCl2單獨和復合處理均能提高樹莓果實中黃酮含量，增強還原力和DPPH自由基清除能力，且CaCl2單獨處理效果較好。結果表明，CaCl2和外源果膠甲酯酶處理可保持樹莓果實的品質，延長貨架期。