牡蠣Cra g 1蛋白大鼠致敏模型的建立與分析

張江濤，張瑞雪，方磊，魏穎，凌空，周明，谷瑞增，魯軍，李國(guó)明

(中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京市蛋白功能肽工程技術(shù)研究中心，北京，100015)

食物過敏一直是人們所面臨的重要安全問題和公共衛(wèi)生問題。據(jù)統(tǒng)計(jì)，有2%～3%的成年人，6%～8%的兒童受到食物過敏的影響[1]。大多數(shù)的食物過敏都屬于免疫球蛋白E(IgE)介導(dǎo)的Ⅰ型過敏反應(yīng)[2]。

牡蠣(生蠔)是世界第一大養(yǎng)殖貝類，也是我國(guó)四大養(yǎng)殖貝類之一[3]。近年來，隨著人們對(duì)貝類等水產(chǎn)品消費(fèi)水平的升高，由食用牡蠣所引發(fā)的過敏反應(yīng)也引起我們的重視。水產(chǎn)品中常見的過敏原有小清蛋白、原肌球蛋白、精氨酸激酶、膠原蛋白、肌鈣結(jié)合蛋白等[4-6]，其中原肌球蛋白是牡蠣的主要過敏原[7]。牡蠣的原肌球蛋白被命名為Crag1，其相對(duì)分子質(zhì)量在37 kDa左右，主要二級(jí)結(jié)構(gòu)為α-螺旋[8-10]。目前人們對(duì)蝦、蟹等其他水產(chǎn)品過敏原的研究相對(duì)較多，而對(duì)牡蠣過敏原表位信息的研究較少，至今尚未明確。

國(guó)內(nèi)外研究大多集中在牡蠣過敏原Crag1的體外實(shí)驗(yàn)(如熱處理、酶解等工藝)方面，迄今為止還沒有關(guān)于建立牡蠣動(dòng)物致敏模型的相關(guān)報(bào)道。在多數(shù)情況下，引起人類過敏的食物，也會(huì)引起動(dòng)物的過敏反應(yīng)，因此通過建立動(dòng)物致敏模型，展開深入機(jī)理研究是非常必要的[11]。棕色挪威大鼠(BN大鼠)是具有高IgE反應(yīng)性的品系，BN大鼠在致敏原刺激下，能產(chǎn)生較高水平的特異性IgE、IgG抗體，具有較強(qiáng)的致敏免疫反應(yīng)[12]。報(bào)道顯示，雌性BN大鼠較雄性BN大鼠而言更易致敏[13]。另外本實(shí)驗(yàn)組先前通過基因重組的方式成功表達(dá)、純化并鑒定了牡蠣過敏原Crag1蛋白[14]，這也為本實(shí)驗(yàn)奠定了相應(yīng)的基礎(chǔ)。與天然提取的Crag1相比，重組表達(dá)的提取過程相對(duì)簡(jiǎn)單、產(chǎn)物純度更高。因此本實(shí)驗(yàn)的目的是利用重組牡蠣Crag1蛋白來致敏雌性BN大鼠，通過觀察BN大鼠的全身主動(dòng)過敏反應(yīng)、體重、體溫、免疫器官指數(shù)，檢測(cè)其血清中總IgE、sIgE、sIgG和血漿中組胺釋放量、血象等指標(biāo)的變化，HE染色觀察腸道組織、肝組織以及腎組織的病理變化，甲苯胺藍(lán)染色觀察腸道組織的肥大細(xì)胞脫顆粒情況，來初步建立牡蠣Crag1蛋白BN大鼠致敏模型，為下一步細(xì)胞致敏模型的建立和基因重組所構(gòu)建的低致敏性牡蠣突變Crag1的過敏原性評(píng)價(jià)提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

雌性棕色挪威大鼠(BN大鼠)：(6～8周齡，24只)，由維通利華動(dòng)物公司提供，許可證號(hào)為SCXK(京) 2016-0006；牡蠣Crag1蛋白，通過基因重組的方式獲得；大鼠IgE酶聯(lián)免疫試劑盒、大鼠組胺試劑盒，上海酶聯(lián)免疫生物公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗大鼠IgE、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗大鼠IgG、抗凝劑EDTA-2K、TMB顯色液、弗氏佐劑、弗氏不完全佐劑、內(nèi)毒素去除試劑盒，Sigma公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 牡蠣Crag1蛋白的制備與純化

登陸NCBI網(wǎng)站，根據(jù)GenBank提供的牡蠣原肌球蛋白Crag1基因序列(登錄號(hào)AB444943.1)，設(shè)計(jì)引物，提取牡蠣總RNA，反轉(zhuǎn)錄cDNA，與pET21a載體連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET21-Crag1。然后將重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌BL21中，篩選陽(yáng)性菌落。

將重組大腸桿菌(BL21)在最佳條件下擴(kuò)大培養(yǎng)并誘導(dǎo)表達(dá)，收獲細(xì)胞沉淀，將細(xì)胞沉淀重懸于溶液(Tris-HCl pH 8.0)中并超聲處理(開啟3 s，關(guān)閉3 s，20 min),離心(15 000 r/min，30 min，4 ℃)后通過0.22 μm過濾膜過濾。將過濾的蛋白質(zhì)溶液加載到KTA-快速蛋白質(zhì)液相色譜(FPLC)系統(tǒng)的帶Ni2+的Hi-Trap螯合HP柱上，用高濃度咪唑洗脫結(jié)合在Ni-柱上的Crag1。另外在原核蛋白表達(dá)中，細(xì)菌內(nèi)毒素去除是比較重要的一個(gè)環(huán)節(jié)，細(xì)菌內(nèi)毒素是細(xì)菌的死體或代謝產(chǎn)物，可引起發(fā)熱、內(nèi)毒素休克、血管凝血等癥狀[15-17]。通過內(nèi)毒素去除試劑盒，除去Crag1蛋白溶液中的內(nèi)毒素，使內(nèi)毒素含量控制在0.1 EU/μg以下。

用BCA法測(cè)蛋白濃度，并貯存在-20 ℃?zhèn)溆?。重組Crag1蛋白與天然Crag1蛋白先前實(shí)驗(yàn)的鑒定與比對(duì)確保了無差異性[14]，為動(dòng)物免疫奠定了基礎(chǔ)。

1.2.2 BN大鼠的免疫

雌性BN大鼠在飼養(yǎng)1周后無異常反應(yīng)，將其隨機(jī)分為2組，牡蠣Crag1蛋白致敏組和PBS對(duì)照組，每組各12只，免疫前采血制備陰性血清。實(shí)驗(yàn)組采用灌胃與腹腔注射相結(jié)合的方式致敏(如圖1)。在第4、11、18、24、31、39天灌胃1 mL的Crag1蛋白(1 mg/mL)；在第1、7、14、28天腹腔注射1 mL的Crag1，(腹腔注射時(shí)，第一次注射Crag1與弗氏佐劑等體積混合，之后注射與弗氏不完全佐劑等體積混合，混合之后濃度為1 mg/mL；在第42天用2 mg/mL的Crag1灌胃和腹腔注射進(jìn)行激發(fā)。對(duì)照組進(jìn)行相同的操作，試劑改為PBS溶液(pH 7.4)。分別于第7，14，21，28，35，42天內(nèi)眥取血，離心分離血清，用于測(cè)定總IgE、特異性IgE和特異性IgG。于14、28、35、42 d眥取血于EDTA-2K抗凝管中，離心分離血漿，用于測(cè)定組胺的含量的變化。

圖1 BN大鼠的致敏流程Fig.1 Sensitization procedure of BN rats

1.2.3 BN大鼠的全身主動(dòng)過敏反應(yīng)評(píng)價(jià)

在第42天通過灌胃和腹腔注射高濃度牡蠣Crag1蛋白進(jìn)行激發(fā)，激發(fā)前后30 min進(jìn)行體溫測(cè)量，觀察BN大鼠體溫變化情況，然后觀察大鼠的全身過敏反映癥狀，并按照何仁靜[18]過敏評(píng)分表(表1)進(jìn)行評(píng)定其表型過敏級(jí)數(shù)。

表1 過敏反應(yīng)級(jí)數(shù)Table 1 Allergy reaction grade

注：-表示沒有過敏；±表示一級(jí)過敏；++表示三級(jí)過敏；+++標(biāo)識(shí)四級(jí)過敏；++++表示五級(jí)過敏。

平均過敏級(jí)數(shù)達(dá)到2級(jí)即可判定為發(fā)生表型過敏反應(yīng)。平均反應(yīng)級(jí)數(shù)和過敏率計(jì)算公式如式(1)、式(2)：

(1)

(2)

1.2.4 BN大鼠體重、免疫臟器和其他主要臟器指數(shù)變化

致敏期間，每周稱體重1次，計(jì)算平均體重，激發(fā)取血后處死BN大鼠，無菌取出胸腺和脾臟，以及腎臟、肝臟，計(jì)算臟器指數(shù)，如公式(3)所示。

(3)

1.2.5 BN大鼠血象指標(biāo)變化

實(shí)驗(yàn)于第14、28、42天取血于含有抗凝劑EDTA-2K抗凝管中，血漿通過血球分析儀分析白細(xì)胞計(jì)數(shù)、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)、嗜酸性細(xì)胞計(jì)數(shù)等血象指標(biāo)。

1.2.6 血清中總IgE、特異性IgE、特異性IgG和血漿中組胺的含量測(cè)定

BN大鼠血清中特異性IgE(特異性IgG)測(cè)定：通過間接ELISA法進(jìn)行檢測(cè)，用濃度為20 μg /mL的牡蠣Crag1蛋白進(jìn)行96孔板包被，4 ℃孵育過夜；PBST洗滌3次，350 μL的5%脫脂奶粉37 ℃封閉1 h； 洗滌3次，加入2%脫脂奶粉稀釋的BN大鼠血清(1∶100)100 μL，室溫下孵育3 h；洗滌3次，每孔加入100 μL稀釋(1∶5 000)的HRP標(biāo)記的山羊抗大鼠IgE(或IgG)，37 ℃孵育1 h；洗滌5次，每孔加入100 μL TMB底物顯色液，避光孵育30 min，最后加入50 μL 2 mol/L的H2SO4終止實(shí)驗(yàn)，用酶標(biāo)儀在450 nm 測(cè)OD值。陰性對(duì)照用未免疫的BN大鼠血清，以PBS為空白對(duì)照調(diào)零。

BN大鼠血清中總IgE、血漿中組胺的含量測(cè)定，均按照ELISA試劑盒的操作說明進(jìn)行。

1.2.7 BN大鼠臟器、腸道病理切片觀察

在第42天取完血后，取其回腸、肝臟、腎臟，用10%的多聚甲醛固定，固定合適時(shí)間后修剪；用不同濃度梯度的乙醇脫水，浸蠟并包埋，之后切片，蘇木精-伊紅染色(HE染色)，顯微鏡下觀察組織病理變化并拍照；甲苯胺藍(lán)染色觀察腸道肥大細(xì)胞脫顆粒情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用Mircrosoft Excel 2010及Origin Pro 8.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，組間檢驗(yàn)采用t檢驗(yàn)，P<0.01 具有極顯著差異(用**表示)；P<0.05 具有顯著差異(用*表示)。

2 結(jié)果與分析

2.1 BN大鼠的全身主動(dòng)過敏反應(yīng)結(jié)果及體溫變化

在第42天激發(fā)實(shí)驗(yàn)后，對(duì)照組BN大鼠無任何異常，均未出現(xiàn)過敏癥狀；實(shí)驗(yàn)組大鼠表現(xiàn)出不同級(jí)別的過敏癥狀：不斷對(duì)鼻子、耳朵、頭周圍以及腹部進(jìn)行抓撓，眼睛或者嘴巴周圍浮腫，活動(dòng)減少；有3只出現(xiàn)顫抖、抽搐等癥狀。根據(jù)表1進(jìn)行具體過敏反應(yīng)級(jí)數(shù)統(tǒng)計(jì)，結(jié)果如圖2所示。

圖2 BN大鼠的過敏反應(yīng)級(jí)數(shù)Fig.2 Allergic reaction series of BN rats

體溫變化情況如表2所示，在高濃度牡蠣Crag1蛋白進(jìn)行激發(fā)前，對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組體溫?zé)o明顯差異，都在(38±0.7)℃。大劑量激發(fā)后，對(duì)照組BN大鼠升高約0.5 ℃，而實(shí)驗(yàn)組出現(xiàn)體溫下降情況，比對(duì)照組平均體溫降低2 ℃，表明牡蠣過敏原蛋白Crag1可以引起B(yǎng)N大鼠體溫下降。李曉燁等[19]通過熱帶螨重組Blot5變應(yīng)原誘導(dǎo)小鼠致敏時(shí)也出現(xiàn)類似現(xiàn)象。

表2 BN大鼠激發(fā)前后的體溫變化Table 2 Changes in body temperature before and after challenge in BN rats

注：*表示不同組間差異顯著(P<0.05);**表示不同組間差異極顯著(P<0.01)，下同。

2.2 BN大鼠體重變化、免疫臟器和其他主要臟器指數(shù)

2.2.1 BN大鼠體重變化

體重變化情況如圖3所示，所有BN大鼠體重均呈現(xiàn)出遞增狀態(tài)，但對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組增長(zhǎng)速度呈現(xiàn)出一定差異，在0～7 d差異不明顯，之后實(shí)驗(yàn)組大鼠體重明顯輕于對(duì)照組，第42天平均體重差接近20 g。牡蠣Crag1蛋白對(duì)BN大鼠體重產(chǎn)生了一定的影響，可能是由于過敏反應(yīng)使其健康狀態(tài)受到影響，使其消化系統(tǒng)乃至吸收系統(tǒng)出現(xiàn)損傷，最終表現(xiàn)為體重增長(zhǎng)緩慢。

圖3 BN大鼠體重變化Fig.3 BN rat body weight changes

2.2.2 免疫臟器和其他主要臟器指數(shù)

臟器指數(shù)如表3所示，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的胸腺、脾臟、腎臟、肝臟指數(shù)均呈現(xiàn)出顯著性差異，實(shí)驗(yàn)組臟器指數(shù)明顯高于對(duì)照組。過敏反應(yīng)屬于免疫應(yīng)答反應(yīng)，胸腺和脾臟都是主要免疫器官，胸腺為T細(xì)胞分化、成熟的場(chǎng)所，對(duì)外周免疫器官和免疫細(xì)胞具有調(diào)節(jié)作用[20]；脾臟能激活B細(xì)胞使其產(chǎn)生大量的抗體，是T細(xì)胞和B細(xì)胞的定居場(chǎng)所，也是免疫應(yīng)答發(fā)生的場(chǎng)所[21]。胸腺和脾臟指數(shù)明顯增大，可能是牡蠣Crag1蛋白所引起的過敏反應(yīng)導(dǎo)致免疫器官腫大。

表3 BN大鼠臟器指數(shù)Table 3 BN rat organ index

2.3 BN大鼠血象指標(biāo)變化情況

過敏反應(yīng)是指已產(chǎn)生免疫的機(jī)體在再次接受相同抗原刺激時(shí)所發(fā)生的一系列過敏現(xiàn)象[22]。與此同時(shí)，機(jī)體內(nèi)細(xì)胞也會(huì)發(fā)生一系列的應(yīng)激反應(yīng)，其數(shù)量和種類也會(huì)發(fā)生變化。白細(xì)胞的數(shù)目隨機(jī)體的健康狀態(tài)不同而有很大波動(dòng)，明顯增加或者減少。白細(xì)胞主要起防衛(wèi)作用，白細(xì)胞并不是均一的細(xì)胞群，根據(jù)其形態(tài)、功能和來源部位可以分為三大類：粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，不同種類的白細(xì)胞以不同的方式參與機(jī)體的防御反應(yīng)[23]。由表4可以看出，實(shí)驗(yàn)組大鼠白細(xì)胞數(shù)量隨著免疫時(shí)間的增加而增加，而對(duì)照組略微降低；在第28天呈現(xiàn)出顯著性差異，第42天激發(fā)后顯示出極顯著差異，這表明BN大鼠在免疫期間一直處于過敏狀態(tài)。中性粒細(xì)胞在第14天呈現(xiàn)出極顯著差異，淋巴細(xì)胞與嗜酸性粒細(xì)胞變化不大，且嗜酸性細(xì)胞稍有所降低，其原因有待深入探究；從總體趨勢(shì)看，實(shí)驗(yàn)組中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量升高。研究表明，嗜酸性粒細(xì)胞在過敏反應(yīng)的調(diào)節(jié)中起重要作用，當(dāng)肥大細(xì)胞或者嗜堿性粒細(xì)胞的表面IgE與相應(yīng)的抗原結(jié)合誘發(fā)過敏反應(yīng)時(shí)，會(huì)產(chǎn)生ECF-A吸引嗜酸性粒細(xì)胞聚集，并釋放組胺酶分解組胺，釋放芳基硫酸酯酶分解白三烯，消除過度炎癥反應(yīng)[24]。這些血象指標(biāo)的明顯變化也進(jìn)一步證明了實(shí)驗(yàn)組BN大鼠對(duì)Crag1蛋白產(chǎn)生了過敏反應(yīng)。

表4 BN大鼠白象指標(biāo)變化Table 2 Changes in bliood index of BN rats

2.4 血清中總IgE、特異性IgE、特異性IgG的含量變化

2.4.1 BN大鼠血清中總IgE的含量

IgE在I型過敏反應(yīng)中起著及其重要的作用，其與效應(yīng)細(xì)胞上的IgE高親和力受體(FcεR I)結(jié)合，從而觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，使肥大細(xì)胞發(fā)生脫顆粒并釋放大量炎性介質(zhì)是過敏性疾病的重要發(fā)病機(jī)制[25]。如圖4所示，隨著致敏時(shí)間的增加，實(shí)驗(yàn)組大鼠體內(nèi)總IgE含量也不斷升高，對(duì)照組稍有波動(dòng)但始終維持在10 μg/mL左右。第7天實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的總IgE含量呈現(xiàn)出顯出性差異，到第42天實(shí)驗(yàn)組總IgE含量達(dá)到44 μg/mL，接近于對(duì)照組的3倍。另外，實(shí)驗(yàn)組第42天與第7天相比有極顯著性差異。免疫期間實(shí)驗(yàn)組總IgE含量不斷升高，對(duì)照組基本不變，可以推斷實(shí)驗(yàn)組BN大鼠產(chǎn)生了嚴(yán)重的過敏反應(yīng)。

圖4 BN大鼠血清總IgE含量Fig.4 Total serum IgE content in BN rats注：*表示不同組間差異顯著(P<0.05);**表示不同組間差異極顯著(P<0.01)。下同。

2.4.2 血清中特異性IgE(sIgE)水平測(cè)定

不同時(shí)期BN大鼠血清的特異性IgE水平變化如圖5-A所示，血清特異性IgE抗體的測(cè)定，可以明確過敏反應(yīng)是由哪種致敏原引起的。從第14天到第42天，實(shí)驗(yàn)組特異性IgE抗體水平呈增加趨勢(shì)，且明顯高于對(duì)照組。在激發(fā)實(shí)驗(yàn)后，實(shí)驗(yàn)組特異性IgE達(dá)到對(duì)照組的2.5倍，與第14天實(shí)驗(yàn)組特異性IgE水平相比也有極顯著性差異。由此可見，BN大鼠的過敏反應(yīng)是由牡蠣Crag1蛋白引起的。

第42天激發(fā)后12只實(shí)驗(yàn)組大鼠血清的特異性IgE水平結(jié)果，如圖5-B所示。12只實(shí)驗(yàn)組BN大鼠均呈現(xiàn)出較高的特異性IgE水平，與對(duì)照組有顯著性差異，再次從血清方面證實(shí)了所有實(shí)驗(yàn)組大鼠均出現(xiàn)了過敏反應(yīng)，過敏原為牡蠣Crag1蛋白。圖5-C顯示了對(duì)牡蠣過敏的人血清與BN大鼠過敏血清的特異性IgE水平比較，人、鼠的過敏血清與對(duì)照組相比均有極顯著性差異，成功獲得其種屬特異性Crag1致敏血清。

A-BN大鼠特異性IgE變化情況；B-第42天激發(fā)后特異性IgE；C-人和BN大鼠的特異性IgE比較; HC-正常人血清；RC-對(duì)照組BN大鼠血清圖5 BN大鼠的IgE變化Fig.5 IgE changes in BN rats

2.4.3 血清中特異性IgG(sIgG)的變化

由圖6可以看出，致敏期間BN大鼠的特異性IgG的變化情況，實(shí)驗(yàn)組隨著致敏時(shí)間增加而增加。動(dòng)物體內(nèi)的sIgG、sIgE、總IgE往往與致敏原敏感性密切相關(guān)，血清sIgG的出現(xiàn)也表明發(fā)生過敏反應(yīng)[26]。然而對(duì)照組sIgG水平低于實(shí)驗(yàn)組，在第14天和第42天呈顯著性差異，但其也有升高趨勢(shì)，具體原因有待進(jìn)一步探究。

圖6 BN大鼠特異性IgG變化Fig.6 BN rat-specific IgG changes

2.5 血漿中的組胺含量

組胺含量的測(cè)定結(jié)果如表5所示，實(shí)驗(yàn)組明顯高于對(duì)照組，且隨著致敏周期不斷增加，第35天達(dá)到約48 ng/mL，比對(duì)照組高60%。組胺也是過敏反應(yīng)中一個(gè)重要的檢測(cè)指標(biāo)，組胺由組氨酸脫羧基而成，組織中的組胺是以無活性的結(jié)合型存在于肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞的顆粒中，當(dāng)機(jī)體受到過敏原刺激時(shí)會(huì)引起這些細(xì)胞脫顆粒，并釋放出組胺等物質(zhì)，與組胺受體作用產(chǎn)生病理生理效應(yīng)[27]。

表5 BN大鼠血漿中組胺的含量 單位：ng/mL

2.6 HE染色和甲苯胺藍(lán)染色結(jié)果

腸道、肝臟、腎臟的HE染色如圖7所示。由圖7-A1可以看出，模型組小腸絨毛上皮脫落、紊亂，固有層水腫、小血管充血、大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，對(duì)照組(7-A2)小腸上皮完好，未見明顯炎癥癥狀。實(shí)驗(yàn)組(7-B1)肝中央靜脈及肝竇均顯著擴(kuò)張充盈血液，部分肝細(xì)胞索斷裂，萎縮，血液融合，形成淤血帶，出現(xiàn)輕度的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；對(duì)照組肝臟(圖7-B2)基本無異常。SCUDAMORE等[28]研究表明，鼠經(jīng)口致敏模擬食物過敏中，其空腔發(fā)生超敏反應(yīng)。炎癥反應(yīng)導(dǎo)致腸道通透性增加，小腸受損，不能被降解的大分子蛋白類過敏原通過門靜脈進(jìn)入肝臟，因而引起肝臟中的免疫反應(yīng)，最終導(dǎo)致肝組織損傷。另外由圖7-C1可以看出，實(shí)驗(yàn)組腎小球分葉明顯，并伴有少量嗜中性粒細(xì)胞及其他炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，腎小球血管擴(kuò)張充血；對(duì)照組(圖7-C2)的腎小球結(jié)構(gòu)清晰，腎小管管腔結(jié)構(gòu)清楚，分泌物少?？赡苁怯捎谶^敏反應(yīng)產(chǎn)生大量的嗜酸細(xì)胞，進(jìn)入腎臟組織，造成模型組BN大鼠的腎臟損害。

由圖7-D1可以看出模型組的腸固有層肥大細(xì)胞聚集增多，脫顆粒肥大細(xì)胞胞膜破裂，邊界不規(guī)則，呈彌散狀，對(duì)照組的大鼠腸道(圖7-D2)固有層肥大細(xì)胞少，胞膜完整．輪廓清晰，大部分不脫顆粒。肥大細(xì)胞是目前公認(rèn)的免疫細(xì)胞，是速發(fā)型過敏反應(yīng)的主要效應(yīng)細(xì)胞。其表面存在于IgE結(jié)合的受體FcεR I，當(dāng)機(jī)體初次接觸過敏原時(shí)，其B細(xì)胞產(chǎn)生的IgE的Fc片段會(huì)與肥大細(xì)胞表面的FcεR I受體結(jié)合；當(dāng)再次接觸過敏原時(shí)，IgE的Fab片段會(huì)與抗原相結(jié)合，促使肥大細(xì)胞產(chǎn)生脫顆粒狀態(tài)，從而分泌組胺、白介素等細(xì)胞因子，從而引發(fā)一系列的過敏反應(yīng)[29-31]。因此肥大細(xì)胞的數(shù)量及脫顆粒情況能夠良好地反映組織過敏情況。由此可以推斷實(shí)驗(yàn)組BN大鼠腸道發(fā)生了較嚴(yán)重的過敏反應(yīng)。

A1-模型組空腸HE染色；A2-對(duì)照組空腸HE染色；B1-模型組肝臟HE染色； B2-對(duì)照組肝臟HE染色性；C1-模型組腎臟HE染色；C2-對(duì)照組腎臟HE染色；D1-模型組空腸甲苯胺藍(lán)染色；D2-對(duì)照組空腸甲苯胺藍(lán)染色。圖7 器官HE與甲苯胺藍(lán)染色結(jié)果Fig.7 results of organ HE and toluidine blue staining

3 結(jié)論

隨著全球?qū)．a(chǎn)品消費(fèi)量的增加，牡蠣過敏現(xiàn)象日益普遍。研究表明，牡蠣主要過敏原Crag1蛋白(原肌球蛋白)的氨基酸序列在多類動(dòng)物中具有很高的同源性，高同源性使易發(fā)生交叉反應(yīng)。動(dòng)物模型是檢測(cè)過敏原最直接可行的方式，本實(shí)驗(yàn)利用重組的Crag1蛋白通過經(jīng)口灌胃與腹腔注射相結(jié)合的方式進(jìn)行免疫BN大鼠，有效避免了經(jīng)口致敏方式可能導(dǎo)致的免疫耐受問題。針對(duì)Crag1蛋白建立BN大鼠致敏模型為研究食物過敏原致敏機(jī)制及其體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)提供較好的工具，也為臨床上預(yù)防及治療食物過敏提供了重要的理論依據(jù)。

本實(shí)驗(yàn)從BN大鼠的表型過敏級(jí)數(shù)以及體重、體溫等方面反映了實(shí)驗(yàn)組大鼠發(fā)生了過敏反應(yīng)；此外，可能是由于過敏反應(yīng)使臟器受損，從而體重低于對(duì)照組，臟器指數(shù)明顯高于對(duì)照組；實(shí)驗(yàn)組白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞以及嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量均出現(xiàn)升高現(xiàn)象；另外，致敏期間實(shí)驗(yàn)組抗體水平(總IgE、sIgE、sIgG)以及組胺釋放量也出現(xiàn)升高現(xiàn)象；染色結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)組臟器出現(xiàn)病變損傷，腸道肥大細(xì)胞脫顆?，F(xiàn)象嚴(yán)重。Th2型淋巴細(xì)胞水平及其釋放相關(guān)細(xì)胞因子的水平以及相關(guān)通路也將在下一步細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中深入探究。本實(shí)驗(yàn)成功建立并分析了牡蠣Crag1蛋白大鼠致敏模型，獲得了Crag1動(dòng)物致敏血清，為下一步細(xì)胞致敏模型的建立和基因重組所構(gòu)建的低敏性牡蠣突變Crag1的過敏原性評(píng)價(jià)提供基礎(chǔ)。