基于高通量測序對中國不同區(qū)域傳統(tǒng)發(fā)酵香腸細菌多樣性的研究

黃鄭朝,宋蓮軍*，黃現(xiàn)青，喬明武，趙秋艷，張平安，劉茜

1(河南農(nóng)業(yè)大學 食品科學技術學院,河南 鄭州,450002) 2(鄭州市大豆深加工重點實驗室,河南 鄭州,450002)

發(fā)酵香腸是指將絞碎的肉、脂肪、糖、食鹽、發(fā)酵劑、香辛料等混合，再灌進腸衣，經(jīng)過微生物發(fā)酵而制成的具有典型發(fā)酵風味的肉制品[1-2]。因其具有風味獨特[3-4]、營養(yǎng)價值高[5]、儲藏時間長等特點，深受全世界消費者的喜愛。發(fā)酵香腸根據(jù)含水量、產(chǎn)地、發(fā)酵程度和加工時間有不同的分類標準而分成不同的產(chǎn)品[6]。中式香腸通常采用自然發(fā)酵方式來制作香腸，由于其微生物復雜多樣，香腸的安全和品質(zhì)沒有質(zhì)量保障。中式香腸相較于國外工業(yè)化生產(chǎn)的香腸來說，擁有自己穩(wěn)定和獨特的微生物群落，并且不同地區(qū)發(fā)酵香腸的微生物群落之間可能具有一定差異，而不同微生物對香腸的品質(zhì)有極大的影響，因此研究各個地區(qū)發(fā)酵香腸微生物分布顯得尤為重要。

微生物發(fā)酵劑具有可以在發(fā)酵過程中產(chǎn)酸和促進水分活度(Aw)下降的能力，可以抑制香腸腐敗和致病微生物的生長，從而延長產(chǎn)品的貨架期[7]。中式香腸作為傳統(tǒng)肉制品最為典型的代表，其生產(chǎn)方式較為落后,不僅加工期長,產(chǎn)品感官欠佳,還存在亞硝胺、生物胺和有害微生物等隱患[8]，菌種篩選在提高香腸食用安全方面一直是研究重點，研究人員在菌種復配和降低香腸生物胺含量方面做了大量研究[9-13]。當前大多數(shù)對發(fā)酵劑的研究都是在傳統(tǒng)微生物技術的基礎上，從環(huán)境中篩選符合預期的菌種，并不能把環(huán)境中所有的微生物進行分離、純化和培養(yǎng)，也不能說明各菌種之間的相互交叉作用，這顯然對研究結果有一定影響。近年來，隨著高通量測序技術的發(fā)展，為難培養(yǎng)微生物的研究提供了技術支持，和傳統(tǒng)微生物技術相比，該方法可以快速獲取樣品中所有微生物的信息并且已廣泛應用到食品、醫(yī)學和環(huán)境科學等領域[14-15]。

本文采用高通量454焦磷酸測序技術，克服了傳統(tǒng)微生物技術耗時耗力和研究不夠全面的缺陷，可以避免細菌在挑菌落不全面、沒有真正顯示出微生物類群的漏洞。收集自中國4個不同地區(qū)的發(fā)酵香腸，可以在一定程度上反映中式香腸細菌群落的分布情況，為中式香腸的安全性研究和下一步香腸發(fā)酵劑的篩選提供一定的理論支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2018年3月于四川成都(SC)、廣東深圳(GD)、湖南長沙(HN)和黑龍江哈爾濱(HB)地區(qū)分別購買傳統(tǒng)發(fā)酵香腸，每個地區(qū)購買5種，采集的樣品均來自當?shù)夭耸袌龌虺校徺I時樣品均已在常溫下儲藏1個月左右，并采用真空包裝的形式在常溫條件下運輸，樣品采集完成后立即進行后續(xù)實驗。

一步式細菌DNAout試劑盒:北京天恩澤基因科技有限公司；聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)用酶:寶生物工程(大連)有限公司。

1.2 儀器與設備

DYY-6C型電泳儀，北京市六一儀器廠；PCR儀，北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司；凝膠成像分析系統(tǒng)，上海勤翔科學儀器有限公司；SX-50型高壓蒸汽滅菌鍋，北京五洲東方科技有限發(fā)展公司；Neofuge-1600R型冷凍高速離心機，上海力申科學儀器有限公司；1300型生物安全柜，賽默飛世爾科技公司；BagMixer40型拍擊式均質(zhì)機，Interscience公司；DH-420電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海樹立儀器儀表有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 試驗分組

香腸根據(jù)不同的地區(qū)分為5組， SC香腸為A組，5種分別編號為A1，A2，A3，A4和A5； GD香腸為B組，5個種類分別編號為B1，B2，B3，B4和B5；HN香腸為C組，5個種類編號分別為C1，C2，C3，C4和C5；HB香腸為D組，5個種類分別編號為D1，D2，D3，D4和D5。

1.3.2 PCR擴增細菌16S rDNA

在無菌條件下，香腸去腸衣，隨機取樣25 g，裝入無菌均質(zhì)袋中，加入150 g無菌生理鹽水，拍擊式均質(zhì)器拍打(2 min)提取細菌，取1.5 mL提取液，離心去除上清液留沉淀備用，按照天恩澤一步式細菌DNAout試劑盒使用說明書提取細菌DNA。338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)作為擴增細菌16S rRNA基因V3-V4區(qū)域的引物。PCR擴增總體積為20 μL，其中含有4 μL 5×FastPfu緩沖液，0.8 μL正向引物(5 μmol/L)，0.8 μL反向引物(5 μmol/L)，2 μL 5 mmol/L dNTPs，0.4 μL FastPfu聚合酶，0.2 μL BSA，10 ng模板DNA，加ddH2O至20 μL。PCR參數(shù)設置參數(shù)如下：95 ℃下變性3 min；循環(huán)數(shù)為36次， 95 ℃下變性30 s，50 ℃下退火30 s，72 ℃下延伸45 s； 72 ℃下延伸10 min。3 μL PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳進行質(zhì)檢。

1.3.3 文庫構建和上機測序

使用TruSeq? DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建庫試劑盒進行文庫構建，構建好的文庫經(jīng)過Qubit和實時熒光定量PCR，文庫合格后，使用v2測序試劑盒(2×250 bp)和MiSeq測序儀進行上機測序[16]。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

每個樣品進行3次重復試驗，所有實驗數(shù)據(jù)均用SPSS 11.0軟件進行數(shù)據(jù)處理，采用單因素方差分析進行多樣本均數(shù)比較，檢驗水準為α=0.05，采用Origin 8.0軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 Pan和Core OTU分析

OTU(operational taxonomic units)是在系統(tǒng)發(fā)生學或群體遺傳學研究中，為了便于進行分析，人為給某一個分類單元(品系，屬，種、分組等)設置的統(tǒng)一標志[17]。Pan OTU指的是泛OTU，是所有樣本所包含的OTU的總和，用于觀測隨著樣本總數(shù)的增加，總OTU數(shù)目的增加情況。Core OTU指的是核心OTU，是所有樣本所共有的OTU總數(shù)目，用于觀測隨著樣本總數(shù)的增加，共有OTU數(shù)目的減少情況。從圖1可以看出，隨著樣品數(shù)量的增加，曲線的變化近似于漸近線，說明樣本量已經(jīng)足夠反映客觀事實。

A-Pan OTU分析；B-Core OTU分析圖1 Pan和Core OTU分析Fig.1 Pan and Core OTU analysis

2.2 細菌多樣性分析

2.2.1 細菌Alpha多樣性分析

Alpha多樣性是指一個特定區(qū)域或者生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)的多樣性，常用的度量標準有Sobs、Chao1、Shannon和Simpson指數(shù)。Sobs是用來表示豐富度實際觀測值的指標，Chao1指數(shù)是生態(tài)學中用來估計物種總數(shù)的常用指數(shù)。Shannon指數(shù)越大，說明群落多樣性越高；Simpson指數(shù)越小，說明群落多樣性和均勻性越高[18]。4個不同地區(qū)之間發(fā)酵香腸細菌多樣性指數(shù)如表1所示。在四川地區(qū)中，A5組的Sobs(160.33±2.08)、Shannon(2.10±0.25)和Chao1(197.47±2.32)指數(shù)要明顯大于其他4組(P<0.05),Simpson指數(shù)要明顯小于其他4組(P<0.05)，A5組在SC香腸中細菌多樣性最豐富。在廣東地區(qū)中，B3組的Sobs(252.00±4.00)、Chao1(266.79±4.32)和Shannon(3.22±0.06)指數(shù)要明顯大于其他4組(P<0.05)，B3組Simpson(0.11±0.01)指數(shù)要明顯小于其他4組(P<0.05)，B3組在GD香腸中細菌多樣性最豐富。在湖南地區(qū)中，C4組的Sobs(208.66±21.38)指數(shù)要明顯大于其他4組(P<0.05);Chao1(246.81±25.81)指數(shù)要明顯大于其他4組(P<0.05)，其中C4和C1組之間不存在顯著性差異。C1組的Simpson指數(shù)要明顯小于其他4組(P<0.05),其中C1組和C2組之間不存在顯著性差異;C1組的Shannon指數(shù)要明顯大于其他4組(P<0.05)，C4組在HN香腸中細菌多樣性最豐富。在哈爾濱地區(qū)中，D3組的Sobs指數(shù)要明顯大于其他4組(P<0.05)；Shannon指數(shù)要明顯大于其他4組(P<0.05)，其中D3組和D5組之間不存在顯著性差異；Simpson指數(shù)要明顯小于其他4組(P<0.05),其中D3組和D5組之間不存在顯著性差異；Chao1指數(shù)也要明顯大于其他4組(P<0.05)，D3組在HB香腸中細菌多樣性最豐富。

表1 細菌多樣性指數(shù)表Table1 Bacterial diversity index

注：相同地區(qū)之間不同字母表示具有顯著性差異(P<0.05)。

2.2.2 細菌Beta多樣性分析

PCOA(principal coordinate analysis)是將聚類分析與主成分分析方法結合起來，用較少的主坐標對分類單元進行有效的排序，不同分組樣本的距離越近，表明樣本物種組成越相近，從圖2中可以看出，哈爾濱香腸和其他3個地區(qū)之間有明顯的不同，廣東和湖南香腸之間沒有明顯的區(qū)分，兩者的細菌在OTU水平上的分布基本上接近一致，四川香腸里面有少部分樣品在OTU水平上的分布同廣東和湖南相似,剩余樣品同其他3個地區(qū)之間有明顯的不同。

圖2 細菌Bray-Curtis距離的PCOA圖Fig.2 PCOA plot of bacterial Bray-Curtis distance

2.3 細菌組成分析

圖3是對各個地區(qū)不同樣品的有效序列進行聚類之后求均值，細菌在菌門水平上的分布圖(相對含量<1%歸為others)。4個地區(qū)60個樣品共檢測到6個菌門，其中厚壁菌門、藍藻門和變形菌門在所有地區(qū)的樣本中占多數(shù)，是樣品中的優(yōu)勢菌門，但是三者在不同區(qū)域樣品中的相對豐度不一樣，在SC和HN中，厚壁菌門占據(jù)絕對優(yōu)勢，在GD中，三者的相對含量大致相同，而在HB中，藍藻門是絕對的優(yōu)勢菌門。

A-SC 發(fā)酵香腸; B-GD發(fā)酵香腸; C-HN 發(fā)酵香腸; D-HB發(fā)酵香腸圖3 細菌群落結構門水平分布圖Fig.3 Bacterial community structure phylum level distribution map

圖4是對各個地區(qū)不同樣品的有效序列進行聚類之后求均值，細菌在菌屬水平上的分布圖(相對含量<1%歸為others)，表2是不同地區(qū)優(yōu)勢菌屬的分布表(占比前3)。所有樣品中共檢測到26個菌屬，4個地區(qū)中均含有無法比對的菌屬存在。其中乳桿菌屬是SC的絕對優(yōu)勢菌屬，相對含量為53.68%，乳球菌屬在GD和HN中的相對含量較高，分別為17.62%和16.04%。在HB中，并沒有哪一種菌屬存在較大的優(yōu)勢，所有的菌屬分布較為均勻，反而無法比對的菌屬占據(jù)了絕大優(yōu)勢，相對含量達到了58.13%，對這些無法確定的細菌還需進一步研究；巨型球菌屬是除了在HB地區(qū)之外都檢測到的優(yōu)勢菌屬。

A-SC發(fā)酵香腸 B-GD 發(fā)酵香腸; C-HN 發(fā)酵香腸; D-HB 發(fā)酵香腸圖4 細菌群落結構屬水平分布圖Fig.4 Distribution of bacterial community structure genus level distribution map

表2 不同地區(qū)優(yōu)勢菌分布表Table 2 Distribution of dominant bacteria in different regions

3 討論

本研究采用高通量測序技術對4個地區(qū)共20種香腸中的細菌群落進行分析，結果發(fā)現(xiàn),從細菌多樣性和OTU重疊角度分析，HN和GD香腸的細菌組成比其他地區(qū)要更加豐富；從主坐標角度分析，SC和HB香腸更具有地區(qū)性。哈爾濱香腸是煙熏熟制而成，并且湖南長沙和廣東深圳兩者都屬于亞熱帶季風氣候,而四川成都和哈爾濱分別屬于亞熱帶季風性濕潤氣候和溫帶季風氣候，加工工藝的不同和氣候的不同很可能導致了香腸細菌分布的不同，進而導致了香腸風味的不同。

在細菌水平上，4個地區(qū)中厚壁菌門，藍藻門和變形菌門占絕對優(yōu)勢，其中SC地區(qū)乳桿菌屬和葡萄球菌屬占優(yōu)勢，GD地區(qū)中乳球菌屬，不動桿菌屬和巨型球菌屬含量較高，HN地區(qū)中乳球菌屬，四聯(lián)疊球菌屬，乳桿菌屬和巨型球菌數(shù)含量較高，前三者都是屬于乳酸菌，HB地區(qū)中，D1樣品中的類芽孢桿菌屬含量較高，剩下的樣品相對于無法比對的細菌來說含量并不是太高，但從中可以看出乳酸菌含量還是具有一定比例。乳酸菌在發(fā)酵肉制品中占優(yōu)勢，和前人的研究結果是一致的[19-21]，其在發(fā)酵肉制品中主要是通過酸化來改變產(chǎn)品的品質(zhì)[22]。巨型球菌屬和葡萄球菌屬在基因上相比[23]，具有相近的進化關系，對4個地區(qū)檢測到的巨型球菌屬進一步在菌種水平劃分，確定該菌為溶酪大球菌。溶酪大球菌呈革蘭氏陽性，早期研究表明該菌種作為內(nèi)源發(fā)酵劑，可提高對脂肪和蛋白質(zhì)的分解作用,并可以耐受一定濃度的食鹽,具有亞硝酸鹽分解能力，并對改善香腸的風味具有一定的積極作用[24-26]，對生物體沒有致病作用[27],通過全基因測序發(fā)現(xiàn)，該菌種和葡萄球菌在代謝途徑上極為相似，但是和葡萄球菌相比，該菌種的染色體較小并且缺少毒力基因[23]。但近期研究表明，該菌的某些菌株對禽類具有感染性[28]，為了食品安全，還需進一步對該菌種做進一步的研究。

在傳統(tǒng)發(fā)酵產(chǎn)品中，本研究結果中微生物多樣性特征和其他學者相比較，大體上是一致的但也有部分差異，例如在傳統(tǒng)發(fā)酵肉制品中，乳酸菌和凝固酶陰性球菌是兩類主要的菌群[29]，本研究結果中除了這兩類細菌之外，藍藻門也占據(jù)了一定比例。引起這種差異可能有以下幾個原因：采樣的時間、氣候，制作香腸的工藝，制作香腸原料肉的肥瘦比，添加香辛料等的不同造成微生物生存環(huán)境的不同，從而造成了這種差異。本研究中存在的未測定微生物可能是因為宏基因組測序數(shù)據(jù)中含有多種未知物種，從而很難確定一段DNA序列來源于何種物種[30]。本課題組選取了4個地區(qū)共20種香腸進行研究，雖然有一定的局限性，但也能夠反映中式香腸細菌群落分布。